أفضل الممارسات لتحليل متغيرات الخط الجرثومي – تسلسل الجيل الثاني والثالث

خلال السنوات الـ 20 الأخيرة، في التحليل الجيني، تقنيات التسلسلتجاوزت طريقة Sanger وبدأت عصر «تسلسل الجيل الثاني» (second generation sequencing= SGS). ويتيح ذلك تسلسل مليارات قطع DNA القصيرة بالتزامن. أما تسلسل الجيل الثالث (third generation sequencing= TGS) فيحدث الآن ثورة بالتحليل الجينومي بقراءة قطع أطول كثيرًا.

يؤدي SGS وTGS دورًا مهمًا لكشف متغيرات الخط الجرثومي وتحليلها.

متغيرات الخط الجرثومي، تغيرات جينية موجودة بجميع خلايا الفرد، ويمكن توريثها عبر الخلايا التناسلية (النطاف أو البويضات). وقد تؤدي دورًا بالأمراض الوراثية وتحدد تركيب الفرد الجيني.

هذه المتغيرات حاسمة لتشخيص الأمراض الوراثية والعلاج الفردي. لكن رغم الإمكانات الواسعة، يلزم الالتزام بمعايير وأفضل ممارسات بكل خطوة تحليل للحصول على نتائج صحيحة.

في 5 نوفمبر 2024 Human Genomics نُشرت فيها مقالة لافتة عن الموضوع. وتهدف هذه المراجعة الشاملة لتقديم دليل للباحثين والأطباء بأفضل الممارسات لتحليل متغيرات الخط الجرثومي ومثيلة DNA باستخدام SGS وTGS.

دراسات مثيلة DNA، من خلال إضافة مجموعات الميثيل للمادة الوراثية وما ينتج عنها من تغيرات فوق جينية تفحصها لفهم تنظيم تعبير الجينات. وتؤدي دورًا مهمًا خصوصًا لتشخيص الأمراض واكتشاف المؤشرات الحيوية وتوضيح آليات التنظيم الجيني.

SGS (تسلسل الجيل الثاني) وTGS (تسلسل الجيل الثالث)، «تسلسل الجيل التالي» (NGS) يمثلان مرحلتين مختلفتين من التقدم التقني العام المعروف بهذا الاسم.

1. تسلسل الجيل التالي (NGS):
   يشمل المصطلح طرق تسلسل أسرع وأقل تكلفة وأعلى إنتاجية من Sanger التقليدية. وكل من SGS و TGSفئة فرعية منه.

2. تسلسل الجيل الثاني (SGS):

   • SGS، تقنية «الجيل الثاني»، توفر عادة دقة مرتفعة بقراءة قطع DNA قصيرة بالتوازي.
   • مثال: منصتا Illumina وIon Torrent.
   • تتكون البيانات عادة من قراءات قصيرة (50-300 زوج قاعدي)، وهذه الطرق قوية خصوصًا لكشف التغيرات الصغيرة (مثل SNV وInDel).

3. تسلسل الجيل الثالث (TGS):

   • TGS، تقنيات «الجيل الثالث»، تستطيع قراءة أجزاء أطول كثيرًا من تسلسلات DNA.
   • مثال: PacBio (HiFi) وOxford Nanopore.
   • تتفوق هذه الطرق في حل بنى جينومية أعقد كالمتغيرات البنيوية (SV) وتحليل DNA المتكرر. وتستطيع كشف التعديلات فوق الجينية مباشرة أيضًا.

في المحصلة، SGS وTGS فرعان مختلفان من NGS، لكل منهما مزايا وحدود بحسب الحاجة الجينومية. ويتجاوز TGS حدود SGS بإمكانات كالقراءة الأطول وتحليل البيانات فوق الجينية.

تحليل متغيرات الخط الجرثومي بـ SGS وTGS

1. تقنية SGS ومعالجة البيانات

يتيح SGS تسلسل قطع DNA قصيرة بالتوازي، بدقة مرتفعة عادة. وتشمل عمليات الجيل الثاني الخطوات التالية:

• محاذاة البيانات: تُحاذى تسلسلات DNA مع الجينوم المرجعي.
• ضبط الجودة: تجب تنقية البيانات وتصفيتها لتقليل أخطاء التسلسل.
• استدعاء المتغيرات: تُكشف متغيرات النوكليوتيد المفرد (SNV) والإدخالات والحذوفات (InDel) في DNA.
• توصيف المتغيرات: تُقيّم الآثار الوظيفية للمتغيرات المكتشفة.

من أدوات معالجة SGS برامج مثل BWA-MEM وGATK وDeepVariant. وتنفذ كشف المتغيرات وتصنيفها بحساسية عالية.

2. تقنية TGS: مزايا القراءات الطويلة

يتجاوز TGS حدود SGS بقراءة أجزاء أطول بكثير من DNA، ويتفوق خصوصًا في تحليل المتغيرات البنيوية (SV) والتسلسلات المتكررة.

• PacBio: يتيح قراءات طويلة عالية الدقة (HiFi)، ويكشف التعديلات فوق الجينية مباشرة.
• Nanopore: يبرز بقراءة DNA طويل، ويعمل نظريًا دون أن يحده طول DNA.

يسهم TGS خصوصًا بصورة مهمة بتشخيص الأمراض الوراثية النادرة وسد فجوات الجينوم.

3. التنميط الجيني لـ HLA وتحليل مناطق تماثل الزيجوت

• التنميط الجيني لـ HLA: لا يمكن تحليل منطقة HLA بطرق استدعاء المتغيرات المعتادة لارتفاع تعدد أشكالها. لذا تُستخدم خوارزميات خاصة كـ HLAminer وOptiType وxHLA.
• مناطق تماثل الزيجوت (ROH): تحليل ROH مهم خصوصًا لكشف جينات الأمراض الجسمية المتنحية. ويُوصى ببرامج H3M2 وBCFTools لتحليل ROH في بيانات SGS وTGS.

تحليل مثيلة DNA

1. أهمية التنظيم فوق الجيني

مثيلة DNA (DNAm) تعديل فوق جيني ينظم التعبير الجيني. وتقدم أنماط مثيلة جزر CpG مؤشرات مميزة بأمراض وراثية وسرطانات كثيرة.

2. طرق تحليل المثيلة

• الطرق القائمة على بيسلفيت الصوديوم: تُعد المعيار الذهبي وتحدد حالة المثيلة في مناطق CpG.
• الطرق القائمة على التسلسل: تحلل تقنيات كـ WGBS وRRBS ملف المثيلة على مستوى الجينوم بدقة مرتفعة.
• تحليل المثيلة بـ TGS: يكشف القواعد المعدلة مباشرة دون الحاجة إلى معالجة DNA كيميائيًا.

3. تحليل البيانات والأدوات

يمكن استخدام MethylKit وDSS وRnBeads لمعالجة بيانات التسلسل ومصفوفات المثيلة الدقيقة معًا. وتُجري تحليلات إثراء وظيفي لتحديد مناطق المثيلة المختلفة (DMR) وتفسير معناها البيولوجي.

الخلاصة والتوصيات

تناولت المراجعة بصورة شاملة فرص تقنيتي SGS وTGS وتحدياتهما في تحليل متغيرات الخط الجرثومي ومثيلة DNA.

• ضبط الجودة: يجب ضبط صارم للجودة طوال العملية لتقليل أخطاء التسلسل.
• البرامج الحديثة: تُوصى أدوات مثل BWA-MEM وDeepVariant وMethylKit لزيادة دقة التحليل.
• أفضل الممارسات: يتيح توحيد التحليلات الجينية وفوق الجينية زيادة دقة التشخيص وتطوير استراتيجيات علاج فردية.

تقدم البيانات الجينومية وفوق الجينية الناتجة عن جمع SGS وTGS تقدمًا رائدًا في وراثة الإنسان والطب الجزيئي. وسيفتح تبنيها الواسع أبوابًا جديدة للتشخيص المبكر والعلاج الموجه.