Передовые методы анализа герминальных вариантов — секвенирование второго и третьего поколений

За последние 20 лет используемые в генетическом анализе технологии секвенирования, превзойдя метод Сэнгера, открыли эпоху «секвенирования второго поколения» (second generation sequencing = SGS). Этот метод позволяет одновременно секвенировать миллиарды коротких последовательностей ДНК. Теперь секвенирование третьего поколения (third generation sequencing = TGS) совершает революцию в геномном анализе, считывая гораздо более длинные последовательности ДНК.

SGS и TGS играют важную роль в выявлении и анализе герминальных вариантов.

Герминальные варианты — это генетические изменения, присутствующие во всех клетках человека и способные передаваться из поколения в поколение через половые клетки (сперматозоиды или яйцеклетки). Эти варианты могут участвовать в развитии наследственных заболеваний и определяют генетическую структуру человека.

Эти варианты имеют решающее значение для диагностики наследственных заболеваний и персонализированных подходов к лечению. Однако, несмотря на широкие возможности этих технологий, для получения точных результатов на каждом этапе анализа необходимо соблюдать определённые стандарты и передовые методы.

5 ноября 2024 года в журнале Human Genomics была опубликована примечательная статья на эту тему. Этот подробный обзор рассматривает передовые методы анализа герминальных вариантов и исследований метилирования ДНК с использованием SGS и TGS и призван стать обстоятельным руководством как для исследователей, так и для врачей.

Исследования метилирования ДНК направлены на понимание регуляции экспрессии генов посредством изучения возникающих при присоединении метильных групп к генетическому материалу эпигенетических изменений. Эти исследования играют важную роль, в частности, в диагностике заболеваний, поиске биомаркеров и выяснении механизмов генетической регуляции.

SGS (Second Generation Sequencing) и TGS (Third Generation Sequencing) в рамках «Next Generation Sequencing» (NGS) представляют две разные ступени общего технологического развития.

1. Секвенирование нового поколения (NGS):
   Этот термин охватывает методы секвенирования, которые по сравнению с традиционным методом Сэнгера отличаются большей скоростью, меньшей стоимостью и высокой производительностью. И SGS, и TGS являются подкатегориями NGS.

2. Секвенирование второго поколения (SGS):

   • SGS обозначает технологию секвенирования «второго поколения», которая обычно обеспечивает высокую точность за счёт параллельного считывания коротких последовательностей ДНК.
   • Примеры: платформы Illumina и Ion Torrent.
   • Данные обычно состоят из коротких прочтений (50-300 пар оснований); эти методы особенно эффективны для выявления небольших генетических изменений, например SNV и InDel.

3. Секвенирование третьего поколения (TGS):

   • TGS обозначает технологии «третьего поколения», способные считывать гораздо более длинные участки последовательностей ДНК.
   • Примеры: PacBio (HiFi) и Oxford Nanopore.
   • Эти методы лучше справляются с более сложными геномными структурами, например со структурными вариантами (SV) и анализом повторяющихся последовательностей ДНК. Они также способны непосредственно выявлять эпигенетические модификации.

Таким образом, SGS и TGS — две разные ветви NGS, каждая из которых имеет преимущества и ограничения в зависимости от задач геномного анализа. Преодолевая ограничения SGS, TGS открывает новые возможности, включая более длинные прочтения и анализ эпигенетических данных.

Анализ герминальных вариантов с помощью SGS и TGS

1. Технология SGS и обработка данных

SGS позволяет параллельно секвенировать короткие фрагменты ДНК и обычно обладает высокой точностью. Секвенирование второго поколения включает следующие этапы:

• Выравнивание данных: последовательности ДНК выравнивают по референсному геному.
• Контроль качества: для сведения ошибок секвенирования к минимуму необходимы очистка и фильтрация данных.
• Выявление вариантов: определяют однонуклеотидные варианты (SNV), вставки и делеции (InDel) в последовательности ДНК.
• Аннотация вариантов: оценивают функциональное влияние выявленных вариантов.

Среди средств обработки данных SGS выделяются BWA-MEM, GATK и DeepVariant. Эти программы выполняют выявление и классификацию вариантов с высокой чувствительностью.

2. Технология TGS: преимущества длинных прочтений

TGS преодолевает ограничения SGS, считывая гораздо более длинные участки последовательностей ДНК. Эта технология особенно эффективна при анализе структурных вариантов (SV) и повторяющихся последовательностей ДНК.

• PacBio: обеспечивает высокоточные длинные прочтения (HiFi) и непосредственно выявляет эпигенетические модификации.
• Nanopore: выделяется способностью считывать длинные последовательности ДНК и теоретически работает без ограничения длиной ДНК.

TGS вносит значительный вклад, в частности, в диагностику редких генетических заболеваний и заполнение пробелов в геноме.

3. Генотипирование HLA и анализ гомозиготных участков

• Генотипирование HLA: из-за высокого уровня полиморфизма область генов HLA невозможно анализировать стандартными методами выявления вариантов. Поэтому используют специальные алгоритмы, такие как HLAminer, OptiType и xHLA.
• Гомозиготные участки (ROH): анализ ROH особенно важен для выявления генов аутосомно-рецессивных заболеваний. Для анализа ROH в данных SGS и TGS рекомендуются программы H3M2 и BCFTools.

Анализ метилирования ДНК

1. Значение эпигенетической регуляции

Метилирование ДНК (DNAm) — эпигенетическая модификация, участвующая в регуляции экспрессии генов. Профили метилирования CpG-островков служат отличительными биомаркерами при многих генетических заболеваниях и видах рака.

2. Методы анализа метилирования

• Методы на основе бисульфита натрия: считаются золотым стандартом и определяют состояние метилирования участков CpG.
• Методы на основе секвенирования: такие технологии, как WGBS и RRBS, позволяют с высоким разрешением анализировать профиль метилирования по всему геному.
• Анализ метилирования с помощью TGS: непосредственно выявляет модифицированные основания, устраняя необходимость химической обработки ДНК.

3. Анализ данных и инструменты

Такие инструменты, как MethylKit, DSS и RnBeads, могут использоваться для обработки как данных секвенирования, так и данных микрочипов метилирования. Они выявляют дифференциально метилированные области (DMR) и выполняют анализ функционального обогащения для интерпретации их биологического значения.

Выводы и рекомендации

В этом обзоре подробно рассмотрены возможности и трудности, связанные с технологиями SGS и TGS, используемыми для анализа герминальных вариантов и метилирования ДНК.

• Контроль качества: на протяжении всего процесса необходим строгий контроль качества для сведения ошибок секвенирования к минимуму.
• Актуальное программное обеспечение: для повышения точности анализа рекомендуются такие инструменты, как BWA-MEM, DeepVariant и MethylKit.
• Передовые методы: стандартизация генетического и эпигенетического анализа повышает точность диагностики и позволяет разрабатывать персонализированные стратегии лечения.

Геномные и эпигенетические данные, полученные при объединении SGS и TGS, обеспечивают прорывные достижения в генетике человека и молекулярной медицине. Широкое внедрение этих технологий откроет новые возможности для ранней диагностики заболеваний и таргетного лечения.