Germinal variant təhlilində ən yaxşı təcrübələr – ikinci və üçüncü nəsil sekvensləmə

Son 20 ildə genetik təhlildə istifadə edilən sekvensləmə texnologiyaları Sanger üsulunu geridə qoyaraq “ikinci nəsil sekvensləmə” (second generation sequencing= SGS) dövrünü başladıb. Bu üsul milyardlarla qısa DNA ardıcıllığını eyni vaxtda sekvensləməyə imkan verir. İndi isə üçüncü nəsil sekvensləmə (third generation sequencing= TGS) daha uzun DNA ardıcıllıqlarını oxuyaraq genomik təhlildə inqilab yaradır.

SGS və TGS germinal variantların aşkarlanmasında və təhlilində mühüm rol oynayır.

Germinal variantlar fərdin bütün hüceyrələrində olan və reproduktiv hüceyrələr (spermatozoid və ya yumurta hüceyrəsi) vasitəsilə nəsildən-nəslə ötürülə bilən genetik dəyişikliklərdir. Bu variantlar irsi xəstəliklərin yaranmasında rol oynaya və fərdin genetik quruluşunu müəyyən edə bilər.

Bu variantlar irsi xəstəliklərin diaqnozunda və fərdiləşdirilmiş müalicə yanaşmalarında həlledici əhəmiyyət daşıyır. Texnologiyaların geniş imkanlarına baxmayaraq düzgün nəticələr əldə etmək üçün təhlilin hər addımında müəyyən standartlara və ən yaxşı təcrübələrə riayət etmək lazımdır.

5 noyabr 2024-cü ildə Human Genomics jurnalında bu mövzuda diqqətəlayiq məqalə yayımlandı. Geniş icmal SGS və TGS ilə aparılan germinal variant və DNA metilləşməsi təhlillərində ən yaxşı təcrübələri araşdıraraq həm tədqiqatçılar, həm də həkimlər üçün əhatəli bələdçi təqdim etməyi hədəfləyir.

DNA metilləşməsi tədqiqatları genetik materiala metil qruplarının əlavə olunması ilə yaranan epigenetik dəyişiklikləri araşdıraraq gen ekspressiyasının necə tənzimləndiyini anlamağı məqsəd qoyur. Bu tədqiqatlar xüsusilə xəstəliklərin diaqnozunda, biomarkerlərin kəşfində və genetik tənzimləmə mexanizmlərinin aydınlaşdırılmasında mühüm rol oynayır.

SGS (Second Generation Sequencing) və TGS (Third Generation Sequencing) “Next Generation Sequencing” (NGS) kimi tanınan ümumi texnoloji irəliləyişin iki ayrı mərhələsidir.

1. Yeni nəsil sekvensləmə (NGS):
   Bu termin ənənəvi Sanger sekvensləməsindən daha sürətli, ucuz və yüksək məhsuldarlıqlı üsulları əhatə edir. Həm SGS, həm də TGS NGS-nin alt kateqoriyalarıdır.

2. İkinci nəsil sekvensləmə (SGS):

   • SGS “ikinci nəsil” sekvensləmə texnologiyasını ifadə edir və adətən qısa DNA ardıcıllıqlarını paralel oxuyaraq yüksək dəqiqlik təmin edir.
   • Nümunə: Illumina və Ion Torrent platformaları.
   • Məlumatlar adətən qısa oxunuşlardan (50-300 nukleotid cütü) ibarətdir və bu üsullar xüsusilə kiçik genetik dəyişiklikləri (məsələn, SNV, InDel) aşkarlamaqda güclüdür.

3. Üçüncü nəsil sekvensləmə (TGS):

   • TGS “üçüncü nəsil” texnologiyaları ifadə edir və DNA ardıcıllıqlarının daha uzun hissələrini oxuya bilir.
   • Nümunə: PacBio (HiFi) və Oxford Nanopore.
   • Bu üsullar struktur variantlar (SV) və təkrarlanan DNA ardıcıllıqlarının təhlili kimi daha mürəkkəb genomik strukturları çözməkdə üstündür. Epigenetik modifikasiyaları da birbaşa aşkarlaya bilir.

Nəticə olaraq, SGS və TGS NGS-nin iki ayrı qoludur və hər biri müəyyən genomik təhlil ehtiyaclarına görə üstünlüklər və məhdudiyyətlər təqdim edir. TGS SGS-nin məhdudiyyətlərini aşaraq daha uzun oxunuş və epigenetik məlumat təhlili kimi yeni imkanlar yaradır.

SGS və TGS ilə germinal variant təhlili

1. SGS texnologiyası və məlumatların işlənməsi

SGS qısa DNA parçalarının paralel sekvenslənməsinə imkan verir və adətən yüksək dəqiqliklə işləyir. İkinci nəsil sekvensləmə prosesləri aşağıdakı addımları əhatə edir:

• Məlumatların düzülməsi: DNA ardıcıllıqları istinad genomuna uyğun düzülür.
• Keyfiyyətə nəzarət: Sekvensləmə xətalarını minimuma endirmək üçün məlumatlar təmizlənməli və filtrlənməlidir.
• Variantların müəyyənləşdirilməsi: DNA ardıcıllığında tək nukleotid variantları (SNV), insersiyalar və delesiyalar (InDel) aşkarlanır.
• Variantların annotasiyası: Aşkarlanan variantların funksional təsirləri qiymətləndirilir.

SGS məlumatlarının işlənməsində BWA-MEM, GATK və DeepVariant kimi proqramlar önə çıxır. Onlar yüksək həssaslıqla variant aşkarlama və təsnifləndirmə əməliyyatları aparır.

2. TGS texnologiyası: uzun oxunuşların üstünlükləri

TGS DNA ardıcıllıqlarının daha uzun hissələrini oxuyaraq SGS-nin məhdudiyyətlərini aşır. Bu texnologiya xüsusilə struktur variantların (SV) və təkrarlanan DNA ardıcıllıqlarının təhlilində üstünlük verir.

• PacBio: Yüksək dəqiqlikli uzun oxunuşlar (HiFi) verir və epigenetik modifikasiyaları birbaşa aşkarlayır.
• Nanopore: Uzun DNA ardıcıllıqlarını oxuma qabiliyyəti ilə seçilir və nəzəri olaraq DNA uzunluğu ilə məhdudlaşmadan işləyir.

TGS xüsusilə nadir genetik xəstəliklərin diaqnozuna və genom boşluqlarının doldurulmasına mühüm töhfə verir.

3. HLA genotiplənməsi və homoziqot bölgələrin təhlili

• HLA genotiplənməsi: HLA gen bölgəsi yüksək polimorfizm səviyyəsinə görə standart variant müəyyənləşdirmə üsulları ilə təhlil edilə bilməz. Buna görə HLAminer, OptiType və xHLA kimi xüsusi alqoritmlər istifadə olunur.
• Homoziqot bölgələr (ROH): ROH təhlili xüsusilə autosom resessiv xəstəlik genlərini aşkarlamaq üçün əhəmiyyətlidir. SGS və TGS məlumatlarında ROH təhlili üçün H3M2 və BCFTools kimi proqramlar tövsiyə olunur.

DNA metilləşməsinin təhlili

1. Epigenetik tənzimləmələrin əhəmiyyəti

DNA metilləşməsi (DNAm) gen ekspressiyasının tənzimlənməsində rol oynayan epigenetik modifikasiyadır. CpG adacıqlarındakı metilləşmə profilləri bir çox genetik xəstəlikdə və xərçəng növündə fərqləndirici biomarkerlər təqdim edir.

2. Metilləşmənin təhlil üsulları

• Natrium bisulfitə əsaslanan üsullar: Qızıl standart sayılır və CpG bölgələrində metilləşmə vəziyyətini müəyyən edir.
• Sekvensləməyə əsaslanan üsullar: WGBS və RRBS kimi üsullar genom üzrə metilləşmə profilini yüksək ayırdetmə qabiliyyəti ilə təhlil edir.
• TGS ilə metilləşmənin təhlili: DNA-nın kimyəvi işlənməsinə ehtiyacı aradan qaldıraraq modifikasiya olunmuş azot əsaslarını birbaşa aşkarlayır.

3. Məlumat təhlili və alətlər

MethylKit, DSS və RnBeads kimi alətlər həm sekvensləmə, həm də metilləşmə mikroarray məlumatlarını işləmək üçün istifadə edilə bilər. Onlar fərqli metilləşmə bölgələrini (DMR) müəyyənləşdirmək və bioloji mənalarını şərh etmək üçün funksional zənginləşdirmə təhlilləri aparır.

Nəticə və tövsiyələr

Bu icmal germinal variant və DNA metilləşməsi təhlilində istifadə edilən SGS və TGS texnologiyalarının imkanlarını və çətinliklərini ətraflı araşdırıb.

• Keyfiyyətə nəzarət: Sekvensləmə xətalarını minimuma endirmək üçün proses boyu ciddi keyfiyyət nəzarəti aparılmalıdır.
• Müasir proqramlar: Təhlilin dəqiqliyini artırmaq üçün BWA-MEM, DeepVariant və MethylKit kimi alətlər tövsiyə olunur.
• Ən yaxşı təcrübələr: Genetik və epigenetik təhlillərin standartlaşdırılması diaqnoz dəqiqliyini artıraraq fərdiləşdirilmiş müalicə strategiyalarının hazırlanmasına imkan verir.

SGS və TGS birləşdirilərək alınan genomik və epigenetik məlumatlar insan genetikası və molekulyar tibbdə yeni yol açan irəliləyişlər təqdim edir. Bu texnologiyaların geniş qəbulu xəstəliklərin erkən diaqnozu və hədəfə yönəlmiş müalicələr üçün yeni qapılar açacaq.