ჩანასახოვანი ხაზის ვარიანტების ანალიზის საუკეთესო პრაქტიკა — მეორე და მესამე თაობის სეკვენირება

ბოლო 20 წლის განმავლობაში გენეტიკურ ანალიზში გამოყენებულმა სეკვენირების ტექნოლოგიებმა Sanger-ის მეთოდს გადააბიჯა და „მეორე თაობის სეკვენირების“ (second generation sequencing= SGS) ეპოქა დაიწყო. ეს მეთოდი მილიარდობით მოკლე დნმ-ის მიმდევრობის ერთდროულ სეკვენირებას შესაძლებელს ხდის. ახლა კი მესამე თაობის სეკვენირება (third generation sequencing= TGS) ბევრად გრძელი დნმ-ის მიმდევრობების წაკითხვით გენომურ ანალიზს გარდაქმნის.

SGS და TGS ჩანასახოვანი ხაზის ვარიანტების გამოვლენასა და ანალიზში მნიშვნელოვან როლს ასრულებს.

ჩანასახოვანი ხაზის ვარიანტები გენეტიკური ცვლილებებია, რომლებიც ინდივიდის ყველა უჯრედში არსებობს და სასქესო უჯრედებით (სპერმატოზოიდით ან კვერცხუჯრედით) თაობიდან თაობას შეიძლება გადაეცეს. მათ შეიძლება მემკვიდრეობითი დაავადებების განვითარებაში შეასრულონ როლი და ინდივიდის გენეტიკური აგებულება განსაზღვრონ.

ამ ვარიანტებს მემკვიდრეობითი დაავადებების დიაგნოსტიკასა და პერსონალიზებულ მკურნალობაში გადამწყვეტი მნიშვნელობა აქვს. თუმცა ტექნოლოგიების ფართო შესაძლებლობების მიუხედავად, ზუსტი შედეგებისთვის ანალიზის ყველა ეტაპზე განსაზღვრული სტანდარტებისა და საუკეთესო პრაქტიკის დაცვაა საჭირო.

2024 წლის 5 ნოემბერს Human Genomics ჟურნალში ამ საკითხზე საყურადღებო სტატია გამოქვეყნდა. ეს ვრცელი მიმოხილვა SGS-ითა და TGS-ით ჩატარებული ჩანასახოვანი ხაზის ვარიანტების ანალიზისა და დნმ-ის მეთილაციის კვლევების საუკეთესო პრაქტიკას განიხილავს და როგორც მკვლევრებისთვის, ისე ექიმებისთვის სრულყოფილი გზამკვლევის შეთავაზებას ისახავს მიზნად.

დნმ-ის მეთილაციის კვლევები გენეტიკურ მასალაზე მეთილის ჯგუფების დამატებით წარმოქმნილი ეპიგენეტიკური ცვლილებების შესწავლით გენური ექსპრესიის რეგულირების გაგებას ისახავს მიზნად. ამ კვლევებს მნიშვნელოვანი როლი აქვს დაავადებების დიაგნოსტიკაში, ბიომარკერების აღმოჩენასა და გენეტიკური რეგულაციის მექანიზმების გარკვევაში.

SGS (Second Generation Sequencing) და TGS (Third Generation Sequencing) „ახალი თაობის სეკვენირების“ (NGS) სახელით ცნობილი საერთო ტექნოლოგიური წინსვლის ორ განსხვავებულ ეტაპს წარმოადგენს.

1. ახალი თაობის სეკვენირება (NGS):
   ტერმინი მოიცავს სეკვენირების მეთოდებს, რომლებიც Sanger-ის ტრადიციულ მეთოდთან შედარებით უფრო სწრაფი, იაფი და მაღალგამტარუნარიანია. როგორც SGS, ისე TGS NGS-ის ქვეკატეგორიაა.

2. მეორე თაობის სეკვენირება (SGS):

   • SGS„მეორე თაობის“ სეკვენირების ტექნოლოგიას აღნიშნავს და ჩვეულებრივ მოკლე დნმ-ის მიმდევრობების პარალელური წაკითხვით მაღალ სიზუსტეს უზრუნველყოფს.
   • მაგალითი: Illumina და Ion Torrent პლატფორმები.
   • მონაცემები, ჩვეულებრივ, მოკლე წაკითხვებისგან (50-300 ფუძის წყვილი) შედგება. ეს მეთოდები განსაკუთრებით მცირე გენეტიკური ცვლილებების (მაგ., SNV, InDel) გამოვლენაში ძლიერია.

3. მესამე თაობის სეკვენირება (TGS):

   • TGS„მესამე თაობის“ ტექნოლოგიებს აღნიშნავს და დნმ-ის მიმდევრობების ბევრად გრძელი მონაკვეთების წაკითხვა შეუძლია.
   • მაგალითი: PacBio (HiFi) და Oxford Nanopore.
   • ეს მეთოდები უპირატესია უფრო რთული გენომური სტრუქტურების შესასწავლად, მაგალითად სტრუქტურული ვარიანტებისა (SV) და განმეორებადი დნმ-ის მიმდევრობების ანალიზისთვის. მათ ეპიგენეტიკური მოდიფიკაციების უშუალოდ გამოვლენაც შეუძლია.

შეჯამების სახით, SGS და TGS NGS-ის ორი განსხვავებული მიმართულებაა და თითოეულს კონკრეტული გენომური ანალიზის საჭიროებების მიხედვით უპირატესობები და შეზღუდვები აქვს. TGS SGS-ის შეზღუდვებს სცდება და ისეთ ახალ შესაძლებლობებს იძლევა, როგორიცაა უფრო გრძელი წაკითხვები და ეპიგენეტიკური მონაცემების ანალიზი.

ჩანასახოვანი ხაზის ვარიანტების ანალიზი SGS-ითა და TGS-ით

1. SGS ტექნოლოგია და მონაცემთა დამუშავება

SGS მოკლე დნმ-ის ფრაგმენტების პარალელურ სეკვენირებას უზრუნველყოფს და ჩვეულებრივ მაღალი სიზუსტით მუშაობს. მეორე თაობის სეკვენირება შემდეგ ნაბიჯებს მოიცავს:

• მონაცემთა გასწორება: დნმ-ის მიმდევრობები რეფერენსულ გენომს ესადაგება.
• ხარისხის კონტროლი: სეკვენირების შეცდომების მინიმუმამდე შესამცირებლად მონაცემთა გაწმენდა და გაფილტვრაა საჭირო.
• ვარიანტების გამოვლენა: ვლინდება დნმ-ის მიმდევრობის ერთნუკლეოტიდური ვარიანტები (SNV), ინსერციები და დელეციები (InDel).
• ვარიანტების ანოტაცია: ფასდება გამოვლენილი ვარიანტების ფუნქციური გავლენა.

SGS მონაცემთა დამუშავების ინსტრუმენტებს შორის გამოირჩევა BWA-MEM, GATK და DeepVariant. ეს პროგრამები ვარიანტების გამოვლენასა და კლასიფიცირებას მაღალი მგრძნობელობით ასრულებს.

2. TGS ტექნოლოგია: გრძელი წაკითხვის უპირატესობები

TGS დნმ-ის მიმდევრობების ბევრად გრძელი მონაკვეთების წაკითხვით SGS-ის შეზღუდვებს სცდება. ტექნოლოგია განსაკუთრებით უპირატესია სტრუქტურული ვარიანტებისა (SV) და განმეორებადი დნმ-ის მიმდევრობების ანალიზში.

• PacBio: უზრუნველყოფს მაღალი სიზუსტის გრძელ წაკითხვებს (HiFi) და ეპიგენეტიკურ მოდიფიკაციებს უშუალოდ ავლენს.
• Nanopore: გამოირჩევა გრძელი დნმ-ის მიმდევრობების წაკითხვით და თეორიულად დნმ-ის სიგრძის შეზღუდვის გარეშე მუშაობს.

TGS-ს მნიშვნელოვანი წვლილი აქვს განსაკუთრებით იშვიათი გენეტიკური დაავადებების დიაგნოსტიკასა და გენომის ხარვეზების შევსებაში.

3. HLA გენოტიპირება და ჰომოზიგოტური უბნების ანალიზი

• HLA გენოტიპირება: HLA გენურ რეგიონს პოლიმორფიზმის მაღალი დონის გამო ვარიანტების გამოვლენის სტანდარტული მეთოდებით ვერ აანალიზებენ. ამიტომ იყენებენ სპეციალურ ალგორითმებს, როგორიცაა HLAminer, OptiType და xHLA.
• ჰომოზიგოტური უბნები (ROH): ROH ანალიზი განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია აუტოსომურ-რეცესიული დაავადებების გენების გამოსავლენად. SGS და TGS მონაცემებში ROH ანალიზისთვის რეკომენდებულია ისეთი პროგრამები, როგორიცაა H3M2 და BCFTools.

დნმ-ის მეთილაციის ანალიზი

1. ეპიგენეტიკური რეგულაციის მნიშვნელობა

დნმ-ის მეთილაცია (DNAm) ეპიგენეტიკური მოდიფიკაციაა, რომელიც გენური ექსპრესიის რეგულაციაში მონაწილეობს. CpG კუნძულების მეთილაციის პროფილები მრავალი გენეტიკური დაავადებისა და კიბოს ტიპისთვის განმასხვავებელ ბიომარკერებს გვთავაზობს.

2. მეთილაციის ანალიზის მეთოდები

• ნატრიუმის ბისულფიტზე დაფუძნებული მეთოდები: ოქროს სტანდარტად მიიჩნევა და CpG უბნებში მეთილაციის მდგომარეობას განსაზღვრავს.
• სეკვენირებაზე დაფუძნებული მეთოდები: WGBS-ისა და RRBS-ის მსგავსი ტექნიკები მთელ გენომში მეთილაციის პროფილს მაღალი გარჩევადობით აანალიზებს.
• მეთილაციის ანალიზი TGS-ით: დნმ-ის ქიმიური დამუშავების საჭიროების აღმოფხვრით მოდიფიცირებულ ფუძეებს უშუალოდ ავლენს.

3. მონაცემთა ანალიზი და ინსტრუმენტები

MethylKit-ის, DSS-ისა და RnBeads-ის მსგავსი ინსტრუმენტები შეიძლება გამოიყენებოდეს როგორც სეკვენირების, ისე მეთილაციის მიკრომატრიცული მონაცემების დასამუშავებლად. ისინი განსხვავებულად მეთილირებული უბნების (DMR) გამოვლენასა და მათი ბიოლოგიური მნიშვნელობის განმარტებისთვის ფუნქციური გამდიდრების ანალიზს ასრულებს.

დასკვნა და რეკომენდაციები

ამ მიმოხილვამ ფართოდ განიხილა ჩანასახოვანი ხაზის ვარიანტებისა და დნმ-ის მეთილაციის ანალიზში გამოყენებული SGS და TGS ტექნოლოგიების შესაძლებლობები და გამოწვევები.

• ხარისხის კონტროლი: სეკვენირების შეცდომების მინიმუმამდე შესამცირებლად მთელი პროცესის განმავლობაში ხარისხის მკაცრი კონტროლი უნდა განხორციელდეს.
• განახლებული პროგრამები: ანალიზის სიზუსტის გასაზრდელად რეკომენდებულია BWA-MEM-ის, DeepVariant-ისა და MethylKit-ის მსგავსი ინსტრუმენტები.
• საუკეთესო პრაქტიკა: გენეტიკური და ეპიგენეტიკური ანალიზების სტანდარტიზაცია დიაგნოზის სიზუსტეს ზრდის და პერსონალიზებული მკურნალობის სტრატეგიების განვითარებას შესაძლებელს ხდის.

SGS-ისა და TGS-ის გაერთიანებით მიღებული გენომური და ეპიგენეტიკური მონაცემები ადამიანის გენეტიკასა და მოლეკულურ მედიცინაში გარდამტეხ წინსვლას გვთავაზობს. ამ ტექნოლოგიების ფართოდ დანერგვა დაავადებების ადრეული დიაგნოსტიკისა და მიზნობრივი მკურნალობისთვის ახალ გზებს გახსნის.