Bewährte Verfahren zur Analyse von Keimbahnvarianten: Sequenzierung der zweiten und dritten Generation

In den vergangenen 20 Jahren haben die in der genetischen Analyse eingesetzten Sequenzierungstechnologien die Sanger-Methode hinter sich gelassen und die Ära der „Sequenzierung der zweiten Generation“ (second generation sequencing = SGS) eingeläutet. Mit diesem Verfahren lassen sich Milliarden kurzer DNA-Sequenzen gleichzeitig sequenzieren. Nun revolutioniert die Sequenzierung der dritten Generation (third generation sequencing = TGS) genomische Analysen, indem sie wesentlich längere DNA-Sequenzen ausliest.

SGS und TGS spielen eine wichtige Rolle beim Nachweis und bei der Analyse von Keimbahnvarianten.

Keimbahnvarianten sind genetische Veränderungen, die in sämtlichen Zellen eines Menschen vorkommen und über Keimzellen, also Spermien oder Eizellen, von Generation zu Generation weitergegeben werden können. Diese Varianten können an der Entstehung erblicher Erkrankungen beteiligt sein und bestimmen die genetische Ausstattung eines Menschen.

Diese Varianten sind für die Diagnose erblicher Erkrankungen und für personalisierte Behandlungsansätze entscheidend. Trotz der vielfältigen Möglichkeiten dieser Technologien müssen jedoch in jedem Analyseschritt bestimmte Standards und bewährte Verfahren eingehalten werden, um korrekte Ergebnisse zu erhalten.

Am 5. November 2024 wurde in Human Genomics ein bemerkenswerter Artikel zu diesem Thema veröffentlicht. Der umfassende Überblick behandelt bewährte Verfahren zur Analyse von Keimbahnvarianten und zur Untersuchung der DNA-Methylierung mittels SGS und TGS. Er soll Forschern und Ärzten einen umfassenden Leitfaden bieten.

Untersuchungen der DNA-Methylierung sollen anhand epigenetischer Veränderungen, die durch die Anlagerung von Methylgruppen an das genetische Material entstehen, erklären, wie die Genexpression reguliert wird. Solche Studien spielen insbesondere bei der Krankheitsdiagnose, der Entdeckung von Biomarkern und der Aufklärung genetischer Regulationsmechanismen eine wichtige Rolle.

SGS (Second Generation Sequencing) und TGS (Third Generation Sequencing) stellen innerhalb der als „Next Generation Sequencing“ (NGS) bekannten allgemeinen technologischen Entwicklung zwei unterschiedliche Stufen dar.

1. Next Generation Sequencing (NGS):
   Dieser Begriff umfasst Sequenzierungsverfahren, die schneller, kostengünstiger und leistungsfähiger sind als die herkömmliche Sanger-Sequenzierung. Sowohl SGS als auch TGS sind Unterkategorien von NGS.

2. Sequenzierung der zweiten Generation (Second Generation Sequencing, SGS):

   • SGS bezeichnet die Sequenzierungstechnologie der „zweiten Generation“, bei der in der Regel kurze DNA-Sequenzen parallel ausgelesen werden, was eine hohe Genauigkeit ermöglicht.
   • Beispiele: die Plattformen Illumina und Ion Torrent.
   • Die Daten bestehen meist aus kurzen Reads (50-300 Basenpaare). Diese Verfahren sind besonders leistungsfähig beim Nachweis kleiner genetischer Veränderungen wie SNV und InDel.

3. Sequenzierung der dritten Generation (Third Generation Sequencing, TGS):

   • TGS bezeichnet Technologien der „dritten Generation“, die wesentlich längere Abschnitte von DNA-Sequenzen auslesen können.
   • Beispiele: PacBio (HiFi) und Oxford Nanopore.
   • Diese Verfahren eignen sich besonders zur Aufklärung komplexerer genomischer Strukturen, etwa struktureller Varianten (SV) und repetitiver DNA-Sequenzen. Zudem können sie epigenetische Modifikationen direkt erkennen.

Zusammenfassend sind SGS und TGS zwei unterschiedliche Zweige von NGS. Je nach Anforderungen der genomischen Analyse bieten sie jeweils Vorteile und Einschränkungen. TGS überwindet Grenzen von SGS und eröffnet neue Möglichkeiten wie längere Reads und die Analyse epigenetischer Daten.

Analyse von Keimbahnvarianten mit SGS und TGS

1. SGS-Technologie und Datenverarbeitung

SGS ermöglicht die parallele Sequenzierung kurzer DNA-Fragmente und arbeitet in der Regel mit hoher Genauigkeit. Die Sequenzierung der zweiten Generation umfasst folgende Schritte:

• Alignment der Daten: DNA-Sequenzen werden am Referenzgenom ausgerichtet.
• Qualitätskontrolle: Die Daten müssen bereinigt und gefiltert werden, um Sequenzierungsfehler auf ein Minimum zu reduzieren.
• Variant Calling: Einzelnukleotidvarianten (SNV), Insertionen und Deletionen (InDel) in der DNA-Sequenz werden erkannt.
• Annotation der Varianten: Die funktionellen Auswirkungen der nachgewiesenen Varianten werden bewertet.

Zu den wichtigen Werkzeugen für die Verarbeitung von SGS-Daten gehören BWA-MEM, GATK und DeepVariant. Diese Programme erkennen und klassifizieren Varianten mit hoher Empfindlichkeit.

2. TGS-Technologie: Vorteile langer Reads

TGS überwindet die Grenzen von SGS, indem es wesentlich längere DNA-Abschnitte ausliest. Diese Technologie bietet insbesondere bei der Analyse struktureller Varianten (SV) und repetitiver DNA-Sequenzen Vorteile.

• PacBio: Liefert hochgenaue lange Reads (HiFi) und erkennt epigenetische Modifikationen direkt.
• Nanopore: Zeichnet sich durch das Auslesen langer DNA-Sequenzen aus und arbeitet theoretisch ohne eine Begrenzung durch die DNA-Länge.

TGS leistet insbesondere bei der Diagnose seltener genetischer Erkrankungen und beim Schließen von Lücken im Genom einen wichtigen Beitrag.

3. HLA-Genotypisierung und Analyse homozygoter Regionen

• HLA-Genotypisierung: Die HLA-Genregion kann wegen ihres hohen Polymorphismus nicht mit Standardverfahren des Variant Calling analysiert werden. Deshalb kommen spezielle Algorithmen wie HLAminer, OptiType und xHLA zum Einsatz.
• Homozygote Regionen (ROH): Die ROH-Analyse ist insbesondere für den Nachweis von Genen autosomal-rezessiver Erkrankungen wichtig. Programme wie H3M2 und BCFTools werden für die ROH-Analyse in SGS- und TGS-Daten empfohlen.

Analyse der DNA-Methylierung

1. Bedeutung epigenetischer Regulation

Die DNA-Methylierung (DNAm) ist eine epigenetische Modifikation, die an der Regulation der Genexpression beteiligt ist. Methylierungsprofile von CpG-Inseln liefern charakteristische Biomarker für zahlreiche genetische Erkrankungen und Krebsarten.

2. Verfahren der Methylierungsanalyse

• Natriumbisulfit-basierte Verfahren: Sie gelten als Goldstandard und bestimmen den Methylierungsstatus von CpG-Regionen.
• Sequenzierungsbasierte Verfahren: Techniken wie WGBS und RRBS analysieren das genomweite Methylierungsprofil mit hoher Auflösung.
• Methylierungsanalyse mit TGS: Erkennt modifizierte Basen direkt und macht eine chemische Behandlung der DNA überflüssig.

3. Datenanalyse und Werkzeuge

Werkzeuge wie MethylKit, DSS und RnBeads können sowohl Sequenzierungsdaten als auch Daten aus Methylierungsmicroarrays verarbeiten. Sie identifizieren unterschiedlich methylierte Regionen (DMR) und führen funktionelle Anreicherungsanalysen durch, um deren biologische Bedeutung zu interpretieren.

Fazit und Empfehlungen

Dieser Überblick behandelte umfassend die Möglichkeiten und Herausforderungen von SGS- und TGS-Technologien bei der Analyse von Keimbahnvarianten und DNA-Methylierung.

• Qualitätskontrolle: Während des gesamten Ablaufs sollte eine strenge Qualitätskontrolle erfolgen, um Sequenzierungsfehler zu minimieren.
• Aktuelle Software: Werkzeuge wie BWA-MEM, DeepVariant und MethylKit werden empfohlen, um die Genauigkeit der Analysen zu erhöhen.
• Bewährte Verfahren: Die Standardisierung genetischer und epigenetischer Analysen verbessert die diagnostische Genauigkeit und ermöglicht die Entwicklung personalisierter Behandlungsstrategien.

Die durch die Kombination von SGS und TGS gewonnenen genomischen und epigenetischen Daten eröffnen bahnbrechende Fortschritte in der Humangenetik und molekularen Medizin. Eine breite Nutzung dieser Technologien wird neue Möglichkeiten für die Früherkennung von Erkrankungen und zielgerichtete Therapien schaffen.