Germline Varyant Analizinde En İyi Uygulamalar – İkinci ve Üçüncü Nesil Sekanslama

Son 20 yılda, genetik analizde kullanılan sekanslama teknolojileri, Sanger yöntemini aşarak "ikinci nesil sekanslama" (second generation sequencing= SGS) dönemini başlatmıştır. Bu yöntem, milyarlarca kısa DNA dizisinin eş zamanlı sekanslanmasına olanak tanımaktadır. Şimdi ise üçüncü nesil sekanslama (third generation sequencing= TGS), çok daha uzun DNA dizilerini okuyarak genomik analizlerde devrim yaratmaktadır.

SGS ve TGS, germline varyantların saptanmasında ve analizinde önemli bir rol oynamaktadır.

Germline varyantlar, bir bireyin tüm hücrelerinde bulunan ve üreme hücreleri (sperm ya da yumurta) yoluyla nesilden nesile aktarılabilen genetik değişikliklerdir. Bu varyantlar, kalıtsal hastalıkların oluşumunda rol oynayabilir ve bireyin genetik yapısını belirler.

Bu varyantlar, kalıtsal hastalıkların tanısında ve kişiselleştirilmiş tedavi yaklaşımlarında kritik bir öneme sahiptir. Ancak bu teknolojilerin sunduğu geniş olanaklara rağmen, doğru sonuçlar elde etmek için analiz süreçlerinin her adımında belirli standartlara ve en iyi uygulamalara uyulması gereklidir.

5 Kasım 2024'te Human Genomics dergisinde bu konuda dikkat çekici bir makale yayımlandı. Bu kapsamlı inceleme, SGS ve TGS kullanılarak yapılan germline varyant analizleri ve DNA metilasyon çalışmalarında en iyi uygulamaları ele alarak, hem araştırmacılar hem de doktorlar için kapsamlı bir rehber sunmayı amaçlamaktadır.

DNA metilasyon çalışmaları, genetik materyal üzerinde metil gruplarının eklenmesiyle oluşan epigenetik değişiklikleri inceleyerek gen ekspresyonunun nasıl düzenlendiğini anlamayı amaçlar. Bu çalışmalar, özellikle hastalıkların tanısında, biyobelirteçlerin keşfinde ve genetik regülasyon mekanizmalarının aydınlatılmasında önemli bir rol oynar.

---

SGS (Second Generation Sequencing) ve TGS (Third Generation Sequencing), "Next Generation Sequencing" (NGS) olarak bilinen genel teknolojik ilerlemenin iki farklı aşamasını temsil eder.

1. Next Generation Sequencing (NGS):
   Bu terim, geleneksel Sanger sekanslama yöntemine kıyasla daha hızlı, daha düşük maliyetli ve yüksek verimli sekanslama yöntemlerini kapsar. Hem SGS hem de TGS, NGS'nin birer alt kategorisidir.

2. Second Generation Sequencing (SGS):

   • SGS, "ikinci nesil" sekanslama teknolojisini ifade eder ve genellikle kısa DNA dizilerini paralel olarak okuyarak yüksek doğruluk sağlar.
   • Örnek: Illumina ve Ion Torrent platformları.
   • Veriler genelde kısa okumalardan (50-300 baz çifti) oluşur ve bu yöntemler, özellikle küçük genetik değişiklikleri (örneğin SNV, InDel) tespit etmekte güçlüdür.

3. Third Generation Sequencing (TGS):

   • TGS, "üçüncü nesil" teknolojileri ifade eder ve DNA dizilerinin çok daha uzun bölümlerini okuyabilir.
   • Örnek: PacBio (HiFi) ve Oxford Nanopore.
   • Bu yöntemler, yapısal varyantlar (SV) ve tekrarlayan DNA dizilerinin analizi gibi daha karmaşık genomik yapıları çözmekte üstündür. Ayrıca epigenetik modifikasyonları doğrudan algılayabilir.

Sonuç olarak, SGS ve TGS, NGS'nin iki farklı dalıdır ve her biri, belirli genomik analiz ihtiyaçlarına göre avantajlar ve sınırlamalar sunar. TGS, SGS’nin sınırlamalarını aşarak daha uzun okuma kapasitesi ve epigenetik veri analizi gibi yeni olanaklar sağlamaktadır.

---

SGS ve TGS ile Germline Varyant Analizi

1. SGS Teknolojisi ve Verilerin İşlenmesi

SGS, kısa DNA parçalarının paralel olarak sekanslanmasını sağlar ve genellikle yüksek doğruluk oranı ile çalışır. İkinci nesil sekanslama süreçleri, şu adımları içermektedir:

• Verilerin hizalanması: DNA dizileri referans genoma karşı hizalanır.
• Kalite kontrol: Sekanslama hatalarının minimuma indirilmesi için verilerin temizlenmesi ve filtrelenmesi gereklidir.
• Varyant çağrımı: DNA dizisindeki tek nükleotid varyantları (SNV), insersiyonlar ve delesyonlar (InDel) tespit edilir.
• Varyantların anotasyonu: Tespit edilen varyantların fonksiyonel etkileri değerlendirilir.

SGS verilerinin işlenmesinde kullanılan araçlar arasında BWA-MEM, GATK ve DeepVariant gibi yazılımlar öne çıkmaktadır. Bu araçlar, yüksek hassasiyetle varyant saptama ve sınıflandırma işlemlerini gerçekleştirmektedir.

2. TGS Teknolojisi: Uzun Okuma Avantajları

TGS, DNA dizilerinin çok daha uzun bölümlerini okuyarak SGS'nin sınırlamalarını aşmaktadır. Bu teknoloji, özellikle yapısal varyantlar (SV) ve tekrarlayan DNA dizilerinin analizinde üstünlük sağlar.

• PacBio: Yüksek doğrulukta uzun okumalar (HiFi) sağlar ve epigenetik modifikasyonları doğrudan algılar.
• Nanopore: Uzun DNA dizilerini okuma yeteneğiyle öne çıkar ve teorik olarak DNA uzunluğu ile sınırlı olmadan çalışır.

TGS'nin özellikle nadir genetik hastalıkların tanısında ve genom boşluklarının doldurulmasında önemli bir katkısı bulunmaktadır.

3. HLA Genotiplemesi ve Homozygote Bölgelerin Analizi

• HLA Genotiplemesi: HLA gen bölgesi, yüksek polimorfizm düzeyi nedeniyle standart varyant çağırma yöntemleriyle analiz edilemez. Bu nedenle HLAminer, OptiType ve xHLA gibi özel algoritmalar kullanılır.
• Homozygote Bölgeler (ROH): ROH analizi, özellikle otozomal resesif hastalık genlerinin saptanmasında önemlidir. H3M2 ve BCFTools gibi yazılımlar, SGS ve TGS verilerinde ROH analizi için önerilmektedir.

---

DNA Metilasyon Analizi

1. Epigenetik Düzenlemelerin Önemi

DNA metilasyonu (DNAm), gen ekspresyonunun düzenlenmesinde rol oynayan bir epigenetik modifikasyondur. CpG adacıkları üzerindeki metilasyon profilleri, birçok genetik hastalık ve kanser türünde ayırt edici biyobelirteçler sunar.

2. Metilasyon Analizi Yöntemleri

• Sodyum Bisülfit Temelli Yöntemler: Altın standart olarak kabul edilir ve CpG bölgelerindeki metilasyon durumunu belirler.
• Sekanslama Temelli Yöntemler: WGBS ve RRBS gibi teknikler, genom çapında metilasyon profilini yüksek çözünürlükle analiz eder.
• TGS ile Metilasyon Analizi: DNA'yı kimyasal olarak işleme gereksinimini ortadan kaldırarak modifiye bazları doğrudan algılar.

3. Veri Analizi ve Araçlar

MethylKit, DSS ve RnBeads gibi araçlar, hem sekanslama hem de metilasyon mikrodizi verilerinin işlenmesinde kullanılabilir. Bu araçlar, farklı metilasyon bölgelerini (DMR) belirlemek ve biyolojik anlamlarını yorumlamak için işlevsel zenginleştirme analizleri yapar.

---

Sonuç ve Öneriler

Bu inceleme, germline varyant ve DNA metilasyon analizinde kullanılan SGS ve TGS teknolojilerinin sunduğu fırsatları ve zorlukları kapsamlı bir şekilde ele almıştır.

• Kalite kontrol: Sekanslama hatalarının minimuma indirilmesi için süreç boyunca sıkı kalite kontrol uygulanmalıdır.
• Güncel yazılımlar: BWA-MEM, DeepVariant, MethylKit gibi araçlar, analiz doğruluğunu artırmak için önerilmektedir.
• En iyi uygulamalar: Genetik ve epigenetik analizlerin standartlaştırılması, tanı doğruluğunu artırarak kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesine olanak tanır.

SGS ve TGS'nin birleştirilmesiyle elde edilen genomik ve epigenetik veriler, insan genetiği ve moleküler tıp alanlarında çığır açıcı ilerlemeler sunmaktadır. Bu teknolojilerin yaygın olarak benimsenmesi, hastalıkların erken tanısı ve hedefe yönelik tedaviler için yeni kapılar açacaktır.