Bune practici în analiza variantelor germinale: secvențierea de a doua și a treia generație

În ultimii 20 de ani, tehnologiile de secvențiere utilizate în analiza genetică au depășit metoda Sanger, inaugurând epoca „secvențierii de a doua generație” (second generation sequencing = SGS). Aceasta permite secvențierea simultană a miliarde de secvențe ADN scurte. În prezent, secvențierea de a treia generație (third generation sequencing = TGS) revoluționează analiza genomică prin citirea unor secvențe ADN mult mai lungi.

SGS și TGS au un rol important în depistarea și analiza variantelor germinale.

Variantele germinale sunt modificări genetice prezente în toate celulele unei persoane, care pot fi transmise din generație în generație prin celulele reproductive (spermatozoizi sau ovule). Ele pot contribui la apariția bolilor ereditare și determină structura genetică individuală.

Aceste variante sunt esențiale pentru diagnosticul bolilor ereditare și abordările terapeutice personalizate. Totuși, în ciuda posibilităților ample oferite de tehnologii, obținerea unor rezultate corecte necesită respectarea standardelor și bunelor practici în fiecare etapă a analizei.

La 5 noiembrie 2024, Human Genomics a publicat un articol remarcabil pe această temă. Analiza amplă abordează bunele practici pentru analiza variantelor germinale și studiile de metilare ADN prin SGS și TGS, urmărind să ofere un ghid cuprinzător atât cercetătorilor, cât și medicilor.

Studiile de metilare ADN urmăresc înțelegerea reglării expresiei genice prin examinarea modificărilor epigenetice produse prin adăugarea grupărilor metil la materialul genetic. Ele au un rol important în special în diagnosticul bolilor, descoperirea biomarkerilor și elucidarea mecanismelor de reglare genetică.

SGS (Second Generation Sequencing) și TGS (Third Generation Sequencing) reprezintă două etape diferite ale progresului tehnologic general cunoscut drept „Next Generation Sequencing” (NGS) .

1. Secvențiere de nouă generație (Next Generation Sequencing, NGS):
   Termenul cuprinde metode de secvențiere mai rapide, mai puțin costisitoare și de mare capacitate față de metoda Sanger tradițională. Atât SGS , cât și TGS sunt subcategorii ale NGS.

2. Secvențiere de a doua generație (Second Generation Sequencing, SGS):

   • SGS desemnează tehnologia de „a doua generație”, care oferă de obicei precizie ridicată prin citirea paralelă a secvențelor ADN scurte.
   • Exemple: platformele Illumina și Ion Torrent.
   • Datele constau, în general, din citiri scurte (50-300 de perechi de baze), iar metodele sunt deosebit de performante în depistarea modificărilor genetice mici (de exemplu, SNV, InDel).

3. Secvențiere de a treia generație (Third Generation Sequencing, TGS):

   • TGS desemnează tehnologiile de „a treia generație” și poate citi regiuni ADN mult mai lungi.
   • Exemple: PacBio (HiFi) și Oxford Nanopore.
   • Metodele sunt superioare în rezolvarea structurilor genomice mai complexe, precum variantele structurale (SV) și secvențele ADN repetitive. Pot depista direct și modificările epigenetice.

În concluzie, SGS și TGS sunt două ramuri diferite ale NGS, fiecare cu avantaje și limite în funcție de necesitățile analizei genomice. Depășind limitele SGS, TGS oferă posibilități noi, precum citiri mai lungi și analiza datelor epigenetice.

Analiza variantelor germinale prin SGS și TGS

1. Tehnologia SGS și procesarea datelor

SGS permite secvențierea paralelă a fragmentelor ADN scurte și funcționează, de regulă, cu precizie ridicată. Secvențierea de a doua generație cuprinde următoarele etape:

• Alinierea datelor: Secvențele ADN sunt aliniate la genomul de referință.
• Controlul calității: Curățarea și filtrarea datelor sunt necesare pentru reducerea la minimum a erorilor de secvențiere.
• Identificarea variantelor: Sunt depistate variantele unui singur nucleotid (SNV), inserțiile și delețiile (InDel) din secvența ADN.
• Adnotarea variantelor: Sunt evaluate efectele funcționale ale variantelor depistate.

Printre instrumentele utilizate pentru procesarea datelor SGS se remarcă BWA-MEM, GATK și DeepVariant. Ele identifică și clasifică variantele cu sensibilitate ridicată.

2. Tehnologia TGS: avantajele citirilor lungi

TGS depășește limitele SGS prin citirea unor regiuni ADN mult mai lungi. Tehnologia oferă avantaje mai ales pentru analiza variantelor structurale (SV) și a secvențelor ADN repetitive.

• PacBio: Oferă citiri lungi cu precizie ridicată (HiFi) și depistează direct modificările epigenetice.
• Nanopore: Se remarcă prin capacitatea de a citi secvențe ADN lungi și funcționează teoretic fără limitarea impusă de lungimea ADN-ului.

TGS contribuie în special la diagnosticul bolilor genetice rare și la completarea lacunelor genomului.

3. Genotiparea HLA și analiza regiunilor homozigote

• Genotiparea HLA: Regiunea genică HLA nu poate fi analizată prin metode standard de identificare a variantelor din cauza polimorfismului ridicat. De aceea sunt utilizați algoritmi speciali, precum HLAminer, OptiType și xHLA.
• Regiuni homozigote (ROH): Analiza ROH este importantă mai ales pentru identificarea genelor bolilor autozomal recesive. Programe precum H3M2 și BCFTools sunt recomandate pentru analiza ROH în datele SGS și TGS.

Analiza metilării ADN

1. Importanța reglării epigenetice

Metilarea ADN (DNAm) este o modificare epigenetică implicată în reglarea expresiei genice. Profilurile de metilare ale insulelor CpG oferă biomarkeri distinctivi pentru numeroase boli genetice și tipuri de cancer.

2. Metode de analiză a metilării

• Metode bazate pe bisulfit de sodiu: Sunt considerate standardul de aur și determină starea metilării în regiunile CpG.
• Metode bazate pe secvențiere: Tehnici precum WGBS și RRBS analizează cu rezoluție ridicată profilul metilării la nivelul întregului genom.
• Analiza metilării prin TGS: Depistează direct bazele modificate și elimină necesitatea prelucrării chimice a ADN-ului.

3. Analiza datelor și instrumente

Instrumente precum MethylKit, DSS și RnBeads pot fi utilizate pentru procesarea datelor atât de secvențiere, cât și de microarray de metilare. Ele identifică regiunile metilate diferențial (DMR) și efectuează analize de îmbogățire funcțională pentru interpretarea semnificației lor biologice.

Concluzii și recomandări

Analiza a examinat în detaliu oportunitățile și dificultățile oferite de tehnologiile SGS și TGS în analiza variantelor germinale și a metilării ADN.

• Controlul calității: Pe tot parcursul procesului trebuie aplicat un control riguros al calității pentru reducerea la minimum a erorilor de secvențiere.
• Programe actualizate: Instrumente precum BWA-MEM, DeepVariant și MethylKit sunt recomandate pentru creșterea preciziei analizei.
• Bune practici: Standardizarea analizelor genetice și epigenetice crește precizia diagnosticului și permite dezvoltarea strategiilor terapeutice personalizate.

Datele genomice și epigenetice obținute prin combinarea SGS și TGS aduc progrese revoluționare în genetica umană și medicina moleculară. Adoptarea pe scară largă a acestor tehnologii va deschide posibilități noi pentru diagnosticul precoce și terapiile țintite.