فك الخريطة الوراثية للسرطان: تقنيات الجيل الجديد للتسلسل بالقراءات الطويلة

لماذا نحتاج إلى تقنيات تسلسل جديدة؟

السرطان مرض ينشأ من مزيج معقد من الطفرات الوراثية ويتقدم وفق قوانين التطور الخلوي. وتعتمد معظم التحليلات الوراثية المستخدمة حتى اليوم لعلاج ملايين مرضى السرطان على تقنيات التسلسل بالقراءات القصيرة (short-read). لكن لهذه التقنية حدودًا مهمة، خصوصًا في كشف إعادة الترتيب الوراثي المعقدة والتغيرات البنيوية الواسعة. وهنا يأتي تسلسل الجيل الثالث (Third Generation Sequencing - TGS)، أو باسمه الآخر التسلسل بالقراءات الطويلة (Long-Read Sequencing - LRS).

تتيح التقنيات الجديدة، خصوصًا منصات مثل PacBio وOxford Nanopore ‏(ONT)، دراسة مناطق الجينوم المعقدة والتغيرات فوق الجينية وبنية الترانسكريبتوم الكاملة بدقة وشمول أكبر. ونتناول في هذه المقالة من جميع الجوانب لماذا يُعد التسلسل بالقراءات الطويلة تطورًا ثوريًا في أبحاث السرطان، وما المجالات التي يبرز فيها.

ملاحظة: التغيرات فوق الجينية، تعديلات كيميائية تؤثر في كيفية عمل الجينات دون تغيير تسلسل DNA (مثل مثيلة DNA). أما بنية الترانسكريبتوم الكاملة فهي مجموع جزيئات RNA المعبر عنها بنشاط داخل الخلية (خصوصًا أشكال mRNA الإسوية). ويساعد تحليل هذه العناصر على فهم كيفية تغير التعبير الجيني في أمراض مثل السرطان وكيفية استجابة الخلايا للتأثيرات البيئية.
وتؤدي أيضًا دورًا حاسمًا في تطوير العلاج الموجّه واكتشاف الواسمات الحيوية.

حدود التسلسل بالقراءات القصيرة: أين يتعثر NGS؟

طُورت بعد الألفية تقنيات التسلسل بالقراءات القصيرة (Next-Generation Sequencing - NGS)، وتستطيع كشف المعلومات الوراثية من قطع DNA قصيرة بتسلسلها مليارات المرات . لكن طول القراءة محدود عادة ببضع مئات من أزواج القواعد فقط. وهذا يسبب قصورها في:

• كشف المتغيرات البنيوية المعقدة (SV)،

• تجميع الجينوم (assembly)،

• تحليلات الترانسكريبتوم مثل متغيرات تضفير RNA،

• والكشف المباشر عن التعديلات فوق الجينية.

فمثلًا، قد تضر أخطاء تضخيم PCR وقلة القراءات في المناطق الغنية بـ GC بتكامل نتائج تسلسل RNA باستخدام NGS.

الجدول 1.ملخص مزايا تقنيات القراءات الطويلة والقصيرة وعيوبها.

ما التسلسل بالقراءات الطويلة، ولماذا هو مهم؟

تقنيات TGS/LRS منصات تقرأ جزيئات DNA أو RNA في قطع أطول بكثير. ويمكن الحصول على قراءات تتجاوز عادة 10.000 bp، بل تصل في بعضها إلى 2 مليون قاعدة. وهذا يتيح تحليل:

• إعادة الترتيب الجينومي المعقدة,

• نسخ mRNA الكاملة الطول,

• التغيرات فوق الجينية (مثل مثيلة DNA),

• تحليل الطور (phasing) على مستوى الخلية المفردة وتفاصيل كثيرة لم تكن متاحة سابقًا باستخدام NGS.

أصبح ممكنًا في قراءات هذه التقنية إنشاء تجميعات جينومية كاملة مخصصة للفرد بدل المحاذاة مع الجينوم المرجعي.

ماذا تقدم كل تقنية؟

وجهت حدود تقنيات التسلسل التقليدية بالقراءات القصيرة (NGS) العلماء إلى حلول جديدة لتحليلات أشمل وأدق. وتقدم تقنيات تسلسل الجيل الثالث (TGS) أدوات قوية إلى حد إحداث ثورة في تحليلات الجينوم والترانسكريبتوم. وفيما يلي مخطط موجز يبين عمل المنصات الثلاث الأكثر استخدامًا وأوجه اختلافها:

A) تقنية تسلسل PacBio HiFi: تصل منصة PacBio قطع DNA بمحولات خاصة «شبيهة بدبوس الشعر» لتكوين SMRTbell ، وهي بنية دائرية. وتُحمّل هذه البنية في خلية SMRT ويُقرأ جزيء DNA نفسه مرات عديدة متتابعة. وتصحح خوارزميات الإجماع الدائري أخطاء هذه القراءات للحصول على قراءة نهائية عالية الدقة.

(B) تقنية تسلسل Oxford Nanopore ‏(ONT): في منصة ONT يُوسم DNA بمحولات تحتوي على بروتين محرك مثبت عند أطرافه. ويُمرر جزيء DNA مفرد عبر مسام نانوي، فتسبب كل قاعدة تغيرًا مميزًا في التيار الكهربائي. ويُفك التسلسل الوراثي بقياس هذه التغيرات. وتتميز بالتسلسل الآني والقدرة على قراءات فائقة الطول.

(C) تقنية تسلسل Illumina (القراءات القصيرة): في نظام Illumina يُقسم DNA إلى قطع صغيرة وتُوسم بمحولات. وبعد إعداد المكتبة يُسلسل كل جزيء DNA فتُنتج قراءات قصيرة كثيرة. ورغم الدقة والإنتاجية المرتفعتين لهذه التقنية، فإنها محدودة من حيث الطول والتعقيد.

أين يُحدث التسلسل بالقراءات الطويلة فرقًا؟

1. كشف الطفرات النقطية وحالات الطور في السرطان

• كما في مثال طفرات EGFR، فإن الأليل الذي توجد عليه طفرتا L858R وT790M مهم جدًا للاستجابة للعلاج.

• تستطيع PacBio وONT تحديد طور هذه الطفرات على مستوى الأليل المفرد.

• يتيح تحليل الطور توقع المريض الذي سيستفيد من أي علاج موجّه.

2. رسم خريطة تفصيلية للمتغيرات البنيوية (SV)

• ثبت أن %55 من الطفرات المحركة في السرطان هي SV.

• في دراسات باستخدام PacBio، أكثر من 20.000 متغير SV لا يمكن كشفه بالقراءات القصيرة اكتُشفت.

• ويتيح ذلك فهمًا أفضل خصوصًا لحذف الجينات الكابحة للورم أو تضخيم الجينات الورمية.

3. تحديد اندماجات جينية جديدة

• إضافة إلى اندماجات معروفة مثل RET وALK وROS1، يمكن تحديد اندماجات جديدة أيضًا.

• أمكن باستخدام ONT، في أقل من 24 ساعة، كشف اندماجات جينية في عينات مُغناة بـ CRISPR–Cas9.

4. تحليل الترانسكريبتوم كامل الطول

• كشفت دراسات سرطاني المعدة والقولون والمستقيم عن أكثر من %60 من الأشكال الإسوية غير المعروفة سابقًا.

• وتبشر هذه الأشكال الإسوية بتحديد واسمات حيوية وأهداف علاجية جديدة.

5. مثيلة DNA والتحليلات فوق الجينية

• يتيح TGS قراءة مثيلات مثل 5-mC و6-mA مباشرة دون الحاجة إلى معالجة كيميائية.

• في أورام الدماغ، أُنجز التشخيص الآني باستخراج نمط المثيلة من عينات أثناء الجراحة خلال 2 ساعة.

6. الخزعة السائلة وتحليل cfDNA

• خلافًا لـ NGS، قد تكفي تغطية منخفضة بالتطبيق الذي يُنتج النتيجة خلال 24 ساعة، ويمكن تقديم نتائج آنية.

• عند تواتر طفرة منخفض يبلغ 0.02%، يمكن حتى كشف طفرات TP53.

• وقد ثبت أن قطع cfDNA الطويلة قد تحمل أيضًا معلومات نوعية للورم.

الجدول 2.ملخص تعقيد البيانات في TGS وNGS.

تحديات المعلوماتية الحيوية ونظرة إلى المستقبل

• لأن بيانات القراءات الطويلة أكبر وأكثر ضجيجًا، تلزم برمجيات تحليل خاصة.

• حُسنت خوارزميات جديدة (مثل Minimap2 وMapquik) لهذه البيانات.

• قد يفرض الحجم الكبير للبيانات ضغطًا ماليًا على مراكز الأبحاث من حيث بنية التخزين والتحليل التحتية.

ما المتوقع مستقبلًا؟

• تسلسل PacBio HiFi مثالي لـ SNV وتحديد الطور؛ أما ONT فله ميزة الطول والسرعة.

• كلما انخفضت الأسعار وازدادت الدقة، سيتسارع دمجه في الممارسة السريرية.

• ستنتشر خرائط الجينوم الكاملة المخصصة للفرد بدل الجينوم المرجعي.

• وسيُمكن تقديم معلومات الإبيجينوم والترانسكريبتوم مع الجينوم بصورة مشتركة.

الخلاصة: تقنيات القراءات الطويلة تفتح عهدًا جديدًا في علاج السرطان

أصبح ممكنًا فهم المتغيرات الوراثية في سياقها، لا مجرد كشفها. وتتيح تقنيات التسلسل بالقراءات الطويلة فهم الأساس البيولوجي للسرطان بشمول أكبر وتطوير نهج العلاج المخصص بدقة أكثر. ويبدو أن هذا التطور الثوري سيجد مكانه قريبًا في العيادات السريرية أيضًا، لا في مختبرات الأبحاث وحدها.