Kanserin Genetik Haritasını Çözmek: Yeni Nesil Uzun Okuma Dizileme Teknolojileri

Neden Yeni Dizileme Teknolojilerine İhtiyacımız Var?

Kanser, genetik mutasyonların karmaşık bir bileşkesinden doğan ve hücresel evrim yasalarına göre ilerleyen bir hastalıktır. Bugüne kadar milyonlarca kanser hastasının tedavisinde kullanılan genetik analizlerin çoğu, kısa okuma (short-read) dizileme teknolojilerine dayanmaktadır. Ancak bu teknoloji, özellikle karmaşık genetik yeniden düzenlemeleri ve büyük ölçekli yapısal değişiklikleri tespit etmede ciddi sınırlamalara sahiptir. İşte burada üçüncü nesil dizileme (Third Generation Sequencing - TGS) ya da diğer adıyla uzun okuma dizileme (Long-Read Sequencing - LRS) devreye giriyor.

Yeni teknolojiler, özellikle PacBio ve Oxford Nanopore (ONT) gibi platformlar sayesinde artık genomun karmaşık bölgeleri, epigenetik değişiklikleri ve tam transkriptom yapısı daha doğru ve kapsamlı bir şekilde incelenebiliyor. Bu yazıda, uzun okuma dizilemenin kanser araştırmalarında neden devrim niteliğinde bir gelişme olduğunu ve hangi alanlarda öne çıktığını tüm yönleriyle ele alacağız.

NOT: Epigenetik değişiklikler, DNA dizisi değişmeden genlerin nasıl çalıştığını etkileyen kimyasal modifikasyonlardır (örneğin DNA metilasyonu). Tam transkriptom yapısı ise bir hücrede aktif olarak ifade edilen tüm RNA moleküllerinin (özellikle mRNA izoformlarının) bütünüdür. Bu unsurların analiz edilmesi, kanser gibi hastalıklarda gen ifadesinin nasıl değiştiğini ve hücrelerin çevresel etkilere nasıl yanıt verdiğini anlamamıza yardımcı olur.
Ayrıca, hedefe yönelik tedavi geliştirmede ve biyobelirteç keşfinde kritik rol oynar.

---

Kısa Okuma Dizilemenin Sınırları: NGS Nerede Tıkanıyor?

Milenyum sonrası geliştirilen kısa okuma dizileme teknolojileri (Next-Generation Sequencing - NGS), kısa DNA parçalarını milyarlarca kez dizileyerek genetik bilgiyi ortaya çıkarabiliyor. Ancak okuma uzunluğu genellikle sadece birkaç yüz baz çifti ile sınırlı. Bu da:

• Karmaşık yapısal varyantların (SV) tespiti,

• Genom montajı (assembly),

• RNA splicing varyantları gibi transkriptom analizleri,

• Epigenetik modifikasyonların doğrudan saptanması gibi konularda yetersiz kalmasına neden oluyor.

Örneğin, NGS ile yapılan RNA dizilemelerinde PCR amplifikasyonunun getirdiği hatalar ve GC-zengin bölgelerdeki okuma azlığı, sonuçların bütünlüğünü olumsuz etkileyebiliyor.

Tablo 1.Uzun ve kısa okuma teknolojilerinin avantaj ve dezavantajlarının özeti.

Uzun Okuma Dizileme Nedir ve Neden Önemlidir?

TGS/LRS teknolojileri, DNA veya RNA moleküllerini çok daha uzun parçalar halinde okuyabilen platformlardır. Genellikle 10.000 bp’nin üzerinde, hatta bazı okumalarda 2 milyon baza kadar ulaşan okuma uzunlukları elde edilebilmektedir. Bu sayede:

• Karmaşık genomik yeniden düzenlemeler,

• Tam uzunlukta mRNA transkriptleri,

• Epigenetik değişiklikler (örn. DNA metilasyonu),

• Tek hücre düzeyinde faz analizi (phasing) gibi daha önce NGS ile ulaşılamayan birçok detay analiz edilebilmektedir.

Bu teknolojiyle yapılan okumalarda artık referans genomla hizalama yapmak yerine, kişiye özgü tam genom montajları oluşturmak mümkün hale gelmektedir.

---

Hangi Teknoloji Ne Sunuyor?

Geleneksel kısa okuma dizileme teknolojilerinin (NGS) sınırlamaları, bilim insanlarını daha kapsamlı ve doğru analizler yapabilecek yeni çözümlere yönlendirdi. Üçüncü nesil dizileme teknolojileri (TGS), hem genom hem de transkriptom analizlerinde devrim yaratacak kadar güçlü araçlar sunuyor. Aşağıda, en yaygın kullanılan üç platformun nasıl çalıştığını ve birbirlerinden hangi yönlerle ayrıldığını gösteren özet bir şema yer almaktadır:

A) PacBio HiFi Dizileme Teknolojisi: PacBio platformu, DNA parçacıklarını özel "saç tokası benzeri" adaptörlerle birleştirerek SMRTbell adı verilen dairesel bir yapı oluşturur. Bu yapı, SMRT hücresine yüklenir ve aynı DNA molekülü birçok kez ardışık olarak okunur. Bu okumalardaki hatalar, dairesel konsensüs algoritmaları ile düzeltilerek yüksek doğrulukta nihai bir okuma elde edilir.

(B) Oxford Nanopore (ONT) Dizileme Teknolojisi: ONT platformunda DNA, uçlarına yerleştirilmiş motor protein içeren adaptörlerle işaretlenir. Tek bir DNA molekülü, nanopordan geçirilir ve her baz, kendine özgü bir elektriksel akım değişimine neden olur. Bu değişimler ölçülerek genetik dizilim çözülür. Gerçek zamanlı dizileme ve ultra uzun okuma kapasitesiyle dikkat çeker.

(C) Illumina (Kısa Okuma) Dizileme Teknolojisi: Illumina sisteminde DNA küçük parçalara ayrılır ve adaptörlerle etiketlenir. Kütüphane hazırlandıktan sonra, her bir DNA molekülü dizilenir ve çok sayıda kısa okuma elde edilir. Bu teknoloji yüksek doğruluk ve yüksek verimlilikle çalışsa da, uzunluk ve karmaşıklık açısından sınırlıdır.

---

Uzun Okuma Dizileme Nerelerde Fark Yaratıyor?

1. Kanserde Nokta Mutasyonların ve Faz Durumlarının Tespiti

• EGFR mutasyonları örneğinde olduğu gibi, L858R ve T790M mutasyonlarının hangi allelde bulunduğu, tedaviye yanıt açısından kritik önem taşır.

• PacBio ve ONT, bu mutasyonları tek allel düzeyinde fazlayabiliyor.

• Faz analizi, hangi hastanın hangi hedefe yönelik tedaviden fayda göreceğini tahmin etmeye olanak sağlar.

2. Yapısal Varyantların (SV) Ayrıntılı Haritalanması

• Kanserde sürücü mutasyonların %55’inin SV olduğu gösterilmiştir.

• PacBio ile yapılan çalışmalarda, kısa okuma ile tespit edilemeyen 20.000’den fazla SV keşfedilmiştir.

• Özellikle tümör baskılayıcı genlerin silinmesi veya onkogenlerin çoğaltılması gibi olaylar daha iyi anlaşılmaktadır.

3. Yeni Gen Füzyonlarının Tanımlanması

• RET, ALK, ROS1 gibi bilinen füzyonlar dışında, yeni füzyonların tanımlanması da mümkün.

• ONT ile 24 saatten kısa sürede, CRISPR–Cas9 ile zenginleştirilmiş örneklerde gen füzyonları tespit edilebilmiştir.

4. Tam Uzunlukta Transkriptom Analizi

• Gastrik ve kolorektal kanserlerde yapılan çalışmalar, daha önce bilinmeyen %60’tan fazla izoformu ortaya koymuştur.

• Bu izoformlar, yeni biyobelirteçlerin ve tedavi hedeflerinin tanımlanmasında umut vericidir.

5. DNA Metilasyonu ve Epigenetik Analizler

• TGS ile 5-mC, 6-mA gibi metilasyonlar doğrudan, kimyasal işlem gerektirmeksizin okunabiliyor.

• Beyin tümörlerinde, intraoperatif örneklerden 2 saat içinde metilasyon profili çıkarılarak gerçek zamanlı tanı sağlanmıştır.

6. Sıvı / Likit Biyopsi ve cfDNA Analizi

• NGS’nin aksine, 24 saatte sonuçlanan uygulama ile düşük kapsama alanı yeterli olabiliyor ve gerçek zamanlı sonuçlar verilebiliyor.

• 0.02% kadar düşük mutasyon frekanslarında bile TP53 mutasyonları saptanabiliyor.

• cfDNA'nın uzun fragmentlerinin de tümöre özgü bilgi taşıyabileceği ortaya konmuştur.

Tablo 2.TGS ve NGS’deki veri karmaşıklığının özeti.

---

Biyoinformatik Zorluklar ve Geleceğe Bakış

• Uzun okuma verisi daha büyük ve gürültülü olduğundan, özel analiz yazılımlarına ihtiyaç duyuluyor.

• Yeni algoritmalar (örneğin, Minimap2, Mapquik) bu veriler için optimize edildi.

• Büyük veri hacmi, depolama ve analiz altyapısı açısından araştırma merkezlerine maliyet baskısı oluşturabilir.

---

Gelecekte Neler Bekleniyor?

• PacBio HiFi sekanslama, SNV ve fazlama için ideal; ONT ise uzunluk ve hız açısından avantajlı.

• Fiyatlar düştükçe ve doğruluk arttıkça klinik pratiğe entegrasyonu hızlanacaktır.

• Referans genom yerine kişiye özgü tam genom haritaları yaygınlaşacak.

• Genomla birlikte epigenom ve transkriptom bilgisi bir arada sunulabilecek.

---

Sonuç: Uzun Okuma Teknolojileri Kanser Tedavisinde Yeni Bir Dönem Başlatıyor

Artık genetik varyantları sadece tespit etmek değil, bağlam içinde anlamlandırmak mümkün. Uzun okuma dizileme teknolojileri, kanserin biyolojik temelini daha bütüncül anlamamıza ve kişiselleştirilmiş tedavi yaklaşımlarını daha isabetli geliştirmemize olanak sağlıyor. Bu devrim niteliğindeki gelişme, yalnızca araştırma laboratuvarlarında değil, yakın gelecekte klinik muayenehanelerde de yerini alacak gibi görünüyor.