رمزگشایی نقشه ژنتیکی سرطان: فناوری‌های نسل جدید توالی‌یابی خوانش بلند

چرا به فناوری‌های تازه توالی‌یابی نیاز داریم؟

سرطان از ترکیب پیچیده جهش‌های ژنتیکی پدید می‌آید و بر اساس قوانین تکامل سلولی پیش می‌رود. بیشتر تحلیل‌های ژنتیکی مورد استفاده تاکنون در درمان میلیون‌ها بیمار، بر فناوری خوانش کوتاه تکیه دارند. اما این فناوری به‌ویژه در شناسایی بازآرایی‌های ژنتیکی پیچیده و تغییرات ساختاری بزرگ محدودیت جدی دارد. اینجاست که توالی‌یابی نسل سوم (TGS)، یا توالی‌یابی خوانش بلند (LRS)، وارد می‌شود.

با فناوری‌های جدید، به‌ویژه پلتفرم‌هایی مانند PacBio و Oxford Nanopore (ONT)، اکنون نواحی پیچیده ژنوم، تغییرات اپی‌ژنتیکی و ساختار کامل ترنسکریپتوم دقیق‌تر و جامع‌تر بررسی می‌شوند. در این مقاله همه جنبه‌های اهمیت تحول‌آفرین خوانش بلند در پژوهش سرطان و حوزه‌های برجسته آن را بررسی می‌کنیم.

نکته: تغییرات اپی‌ژنتیکی اصلاحات شیمیایی مؤثر بر عملکرد ژن بدون تغییر توالی DNA هستند، مانند متیلاسیون DNA. ساختار کامل ترنسکریپتوم مجموعه تمام مولکول‌های RNA فعالانه بیان‌شده در یک سلول، به‌ویژه ایزوفرم‌های mRNA، است. تحلیل این موارد به شناخت تغییر بیان ژن و پاسخ سلول به محیط در بیماری‌هایی مانند سرطان کمک می‌کند.
همچنین در ساخت درمان هدفمند و کشف نشانگر زیستی نقشی حیاتی دارد.

محدودیت خوانش کوتاه: NGS کجا با مانع روبه‌رو می‌شود؟

فناوری‌های توسعه‌یافته پس از آغاز هزاره، یعنی توالی‌یابی خوانش کوتاه (توالی‌یابی نسل جدید، NGS)با بررسی قطعات کوتاه DNA و میلیاردها بار توالی‌یابی آن‌ها، اطلاعات ژنتیکی را آشکار می‌کنند. اما طول خوانش معمولاً فقط چند صد جفت‌باز است؛ در نتیجه در این زمینه‌ها کافی نیستند:

• شناسایی واریانت‌های ساختاری پیچیده (SV)،

• مونتاژ ژنوم،

• تحلیل ترنسکریپتوم مانند واریانت‌های پیرایش RNA،

• شناسایی مستقیم اصلاحات اپی‌ژنتیکی.

برای نمونه در توالی‌یابی RNA با NGS، خطاهای تکثیر PCR و کمبود خوانش نواحی غنی از GC می‌توانند یکپارچگی نتایج را مختل کنند.

جدول 1. خلاصه مزایا و معایب فناوری‌های خوانش بلند و کوتاه.

توالی‌یابی خوانش بلند چیست و چرا مهم است؟

فناوری‌های TGS/LRS پلتفرم‌هایی هستند که DNA یا RNA را در قطعات بسیار بلندتر می‌خوانند. طول خوانش معمولاً بیش از 10000 bp است و در برخی خوانش‌ها حتی به 2 میلیون باز می‌رسد. با این روش می‌توان جزئیاتی را تحلیل کرد که قبلاً با NGS دست‌یافتنی نبودند:

• بازآرایی‌های پیچیده ژنومی,

• رونوشت‌های تمام‌طول mRNA,

• تغییرات اپی‌ژنتیکی مانند متیلاسیون DNA,

• تحلیل فاز در سطح تک‌سلول .

با خوانش‌های این فناوری، اکنون به‌جای هم‌ترازسازی با ژنوم مرجع می‌توان مونتاژهای کامل ژنوم ویژه هر فرد را ساخت.

هر فناوری چه ارائه می‌کند؟

محدودیت توالی‌یابی متداول خوانش کوتاه (NGS)، دانشمندان را به سوی راه‌حل‌های تازه برای تحلیل جامع‌تر و دقیق‌تر برده است. فناوری‌های نسل سوم (TGS) ابزارهایی با توان دگرگون کردن تحلیل ژنوم و ترنسکریپتوم دارند. در ادامه، نمودار خلاصه‌ای از روش کار سه پلتفرم رایج و تفاوت آن‌ها آمده است:

A) فناوری توالی‌یابی PacBio HiFi: پلتفرم PacBio قطعات DNA را با آداپتورهای ویژه شبیه «سنجاق‌سر» به هم متصل می‌کند و ساختاری حلقوی به نام SMRTbell می‌سازد. این ساختار در سلول SMRT بارگذاری می‌شود و همان مولکول DNA بارها پیاپی خوانده می‌شود. خطاها با الگوریتم‌های توافق حلقوی اصلاح و خوانش نهایی با دقت بالا حاصل می‌شود.

(B) فناوری توالی‌یابی Oxford Nanopore (ONT): در پلتفرم ONT، DNA با آداپتورهای حاوی پروتئین حرکتی در انتها علامت‌گذاری می‌شود. یک مولکول DNA از نانوحفره عبور می‌کند و هر باز تغییر ویژه‌ای در جریان الکتریکی ایجاد می‌کند. با اندازه‌گیری این تغییرات، توالی ژنتیکی رمزگشایی می‌شود. ظرفیت توالی‌یابی بلادرنگ و خوانش فوق‌بلند آن برجسته است.

(C) فناوری توالی‌یابی Illumina (خوانش کوتاه): در Illumina، DNA به قطعات کوچک تقسیم و با آداپتور برچسب‌گذاری می‌شود. پس از تهیه کتابخانه، هر مولکول DNA توالی‌یابی می‌شود و خوانش‌های کوتاه فراوان به دست می‌آیند. این فناوری با دقت و بازده بالا کار می‌کند، اما از نظر طول و پیچیدگی محدود است.

خوانش بلند در کجا تفاوت ایجاد می‌کند؟

1. شناسایی جهش‌های نقطه‌ای و وضعیت فاز در سرطان

• برای نمونه در جهش EGFR، اینکه L858R و T790M روی کدام الل قرار دارند برای پاسخ درمانی حیاتی است.

• PacBio و ONT می‌توانند این جهش‌ها را در سطح یک الل فازبندی کنند.

• تحلیل فاز به پیش‌بینی اینکه کدام بیمار از کدام درمان هدفمند سود می‌برد کمک می‌کند.

2. نقشه‌برداری تفصیلی واریانت‌های ساختاری (SV)

• نشان داده شده 55% جهش‌های محرک سرطان، SV هستند.

• در مطالعات PacBio، بیش از 20000 واریانت SV غیرقابل‌شناسایی با خوانش کوتاه کشف شده‌اند.

• به‌ویژه حذف ژن سرکوبگر تومور یا افزایش نسخه انکوژن بهتر شناخته می‌شود.

3. شناسایی فیوژن‌های ژنی جدید

• علاوه بر فیوژن‌های شناخته‌شده RET، ALK و ROS1، شناسایی فیوژن‌های تازه نیز ممکن است.

• با ONT، فیوژن ژنی در نمونه‌های غنی‌شده با CRISPR–Cas9 در کمتر از 24 ساعت شناسایی شده است.

4. تحلیل ترنسکریپتوم تمام‌طول

• مطالعات سرطان معده و کولورکتال، بیش از 60% ایزوفرم پیش‌تر ناشناخته را آشکار کرده‌اند.

• این ایزوفرم‌ها برای شناسایی نشانگر زیستی و هدف درمانی جدید امیدبخش‌اند.

5. متیلاسیون DNA و تحلیل اپی‌ژنتیکی

• با TGS، متیلاسیون‌هایی مانند 5-mC و 6-mA مستقیم و بدون فرایند شیمیایی خوانده می‌شوند.

• در تومورهای مغزی، از نمونه حین جراحی، نمایه متیلاسیون طی 2 ساعت استخراج و تشخیص بلادرنگ انجام شده است.

6. بیوپسی مایع و تحلیل cfDNA

• برخلاف NGS، روشی که در 24 ساعت نتیجه می‌دهد ممکن است به پوشش پایین نیاز داشته باشد و نتیجه بلادرنگ فراهم کند.

• حتی در فراوانی جهش به کمی 0.02%، جهش‌های TP53 شناسایی می‌شوند.

• نشان داده شده قطعات بلند cfDNA نیز می‌توانند اطلاعات اختصاصی تومور داشته باشند.

جدول 2. خلاصه پیچیدگی داده در TGS و NGS.

چالش‌های زیست‌اطلاعاتی و چشم‌انداز آینده

• چون داده خوانش بلند بزرگ‌تر و پرنویزتر است، به نرم‌افزار تحلیل ویژه نیاز دارد.

• الگوریتم‌های تازه، مانند Minimap2 و Mapquik، برای این داده‌ها بهینه شده‌اند.

• حجم زیاد داده ممکن است از نظر زیرساخت ذخیره‌سازی و تحلیل، فشار مالی بر مراکز پژوهشی وارد کند.

در آینده چه انتظار می‌رود؟

• توالی‌یابی PacBio HiFi برای SNV و فازبندی ایده‌آل است؛ ONT از نظر طول و سرعت مزیت دارد.

• با کاهش قیمت و افزایش دقت، ادغام در کار بالینی سریع‌تر خواهد شد.

• نقشه کامل ژنوم ویژه فرد به‌جای ژنوم مرجع فراگیر خواهد شد.

• اطلاعات ژنوم، اپی‌ژنوم و ترنسکریپتوم را می‌توان یکجا ارائه کرد.

نتیجه: فناوری خوانش بلند دورانی تازه در درمان سرطان می‌گشاید

اکنون نه‌فقط شناسایی واریانت ژنتیکی، بلکه درک آن در زمینه مربوط ممکن است. توالی‌یابی خوانش بلند به شناخت جامع‌تر مبنای زیستی سرطان و ساخت دقیق‌تر درمان شخصی کمک می‌کند. به نظر می‌رسد این پیشرفت تحول‌آفرین در آینده نزدیک علاوه بر آزمایشگاه پژوهش، در مطب بالینی نیز جای بگیرد.