Descifrarea hărții genetice a cancerului: tehnologii de nouă generație pentru secvențierea cu citiri lungi

De ce avem nevoie de noi tehnologii de secvențiere?

Cancerul este o boală care rezultă dintr-o combinație complexă de mutații genetice și evoluează conform legilor evoluției celulare. Majoritatea analizelor genetice folosite până acum în tratamentul a milioane de pacienți cu cancer se bazează pe tehnologii de secvențiere cu citiri scurte (short-read). Totuși, acestea au limitări importante, mai ales în detectarea rearanjamentelor genetice complexe și a modificărilor structurale de amploare. Aici intervin secvențierea de a treia generație (Third Generation Sequencing – TGS), numită și secvențiere cu citiri lungi (Long-Read Sequencing – LRS).

Datorită noilor tehnologii, în special platformelor precum PacBio și Oxford Nanopore (ONT), regiunile complexe ale genomului, modificările epigenetice și structura completă a transcriptomului pot fi acum analizate mai precis și mai cuprinzător. În acest articol vom examina în detaliu de ce secvențierea cu citiri lungi reprezintă un progres revoluționar în cercetarea cancerului și în ce domenii se remarcă.

NOTĂ: Modificările epigenetice sunt modificări chimice care influențează funcționarea genelor fără a schimba secvența ADN (de exemplu, metilarea ADN). Structura completă a transcriptomului reprezintă totalitatea moleculelor de ARN exprimate activ într-o celulă (în special a izoformelor ARNm). Analiza acestor elemente ne ajută să înțelegem cum se modifică expresia genelor în boli precum cancerul și cum răspund celulele la influențele mediului.
De asemenea, are un rol esențial în dezvoltarea terapiilor țintite și descoperirea biomarkerilor.

Limitele secvențierii cu citiri scurte: unde se blochează NGS?

Dezvoltate după începutul mileniului, tehnologiile de secvențiere cu citiri scurte (Next-Generation Sequencing – NGS)pot dezvălui informația genetică din fragmente scurte de ADN prin secvențiere de miliarde de ori . Totuși, lungimea citirii este de obicei limitată la câteva sute de perechi de baze. Aceasta le limitează capacitatea în:

• Detectarea variantelor structurale complexe (SV),

• Asamblarea genomului (assembly),

• Analize transcriptomice, precum variantele de splicing ale ARN,

• Detectarea directă a modificărilor epigenetice.

De exemplu, la secvențierea ARN prin NGS, erorile introduse de amplificarea PCR și numărul redus de citiri în regiunile bogate în GC pot afecta integritatea rezultatelor.

Tabelul 1. Sinteza avantajelor și dezavantajelor tehnologiilor cu citiri lungi și scurte.

Ce este secvențierea cu citiri lungi și de ce este importantă?

Tehnologiile TGS/LRS sunt platforme care pot citi moleculele de ADN sau ARN în fragmente mult mai lungi. Se obțin de obicei citiri de peste 10000 bp, unele ajungând chiar la 2 milioane de baze. Astfel pot fi analizate multe detalii inaccesibile anterior prin NGS, precum:

• Rearanjamente genomice complexe,

• Transcripte ARNm de lungime completă,

• Modificări epigenetice (de exemplu, metilarea ADN),

• Analiza fazării (phasing) la nivel de celulă unică .

Cu citirile obținute prin această tehnologie, este acum posibilă crearea unor asamblări complete ale genomului individual, în locul alinierii la genomul de referință.

Ce oferă fiecare tehnologie?

Limitările tehnologiilor convenționale de secvențiere cu citiri scurte (NGS) i-au îndreptat pe cercetători spre noi soluții pentru analize mai precise și mai cuprinzătoare. Tehnologiile de secvențiere de a treia generație (TGS) oferă instrumente suficient de puternice pentru a revoluționa analiza genomului și a transcriptomului. Schema de mai jos rezumă funcționarea celor mai utilizate trei platforme și diferențele dintre ele:

A) Tehnologia de secvențiere PacBio HiFi: Platforma PacBio unește fragmentele de ADN cu adaptoare speciale, asemănătoare unor agrafe, formând o structură circulară numită SMRTbell . Aceasta este încărcată într-o celulă SMRT, iar aceeași moleculă de ADN este citită succesiv de mai multe ori. Erorile citirilor sunt corectate prin algoritmi de consens circular, obținându-se o citire finală cu precizie ridicată.

(B) Tehnologia de secvențiere Oxford Nanopore (ONT): În platforma ONT, ADN-ul este marcat cu adaptoare care conțin o proteină motor la capete. O singură moleculă de ADN trece printr-un nanopor, fiecare bază producând o modificare specifică a curentului electric. Măsurarea acestor modificări permite descifrarea secvenței genetice. Tehnologia se remarcă prin secvențierea în timp real și capacitatea de citire ultralungă.

(C) Tehnologia de secvențiere Illumina (citiri scurte): În sistemul Illumina, ADN-ul este fragmentat în bucăți mici și marcat cu adaptoare. După pregătirea bibliotecii, fiecare moleculă de ADN este secvențiată, obținându-se numeroase citiri scurte. Deși tehnologia oferă precizie și randament ridicate, este limitată în privința lungimii și complexității.

Unde face diferența secvențierea cu citiri lungi?

1. Detectarea mutațiilor punctiforme și a fazării în cancer

• Ca în exemplul mutațiilor EGFR, alela pe care se află mutațiile L858R și T790M este esențială pentru răspunsul la tratament.

• PacBio și ONT pot determina fazarea acestor mutații la nivelul unei singure alele.

• Analiza fazării permite anticiparea terapiei țintite de care ar putea beneficia fiecare pacient.

2. Cartografierea detaliată a variantelor structurale (SV)

• S-a demonstrat că 55% dintre mutațiile driver din cancer sunt SV.

• În studiile realizate cu PacBio au fost descoperite peste 20000 de SV nedetectabile prin citiri scurte .

• Sunt mai bine înțelese în special evenimente precum deleția genelor supresoare tumorale sau amplificarea oncogenelor.

3. Identificarea unor noi fuziuni genice

• Pe lângă fuziunile cunoscute, precum RET, ALK și ROS1, pot fi identificate și fuziuni noi.

• Cu ONT au fost detectate fuziuni genice în mai puțin de 24 de ore, în probe îmbogățite cu CRISPR–Cas9.

4. Analiza transcriptomului de lungime completă

• Studiile în cancere gastrice și colorectale au evidențiat peste 60% izoforme necunoscute anterior.

• Aceste izoforme sunt promițătoare pentru identificarea unor noi biomarkeri și ținte terapeutice.

5. Metilarea ADN și analize epigenetice

• Prin TGS, metilări precum 5-mC și 6-mA pot fi citite direct, fără tratament chimic.

• În tumorile cerebrale, obținerea profilului de metilare din probe intraoperatorii în decurs de 2 ore a permis diagnosticul în timp real.

6. Biopsia lichidă și analiza cfDNA

• Spre deosebire de NGS, în aplicația care oferă rezultate în 24 de ore poate fi suficientă o acoperire redusă, fiind posibile rezultate în timp real.

• Mutațiile TP53 pot fi detectate chiar și la frecvențe ale mutațiilor de numai 0,02%.

• S-a arătat că și fragmentele lungi de cfDNA pot conține informații specifice tumorii.

Tabelul 2. Sinteza complexității datelor în TGS și NGS.

Provocări bioinformatice și perspective

• Deoarece datele din citirile lungi sunt mai voluminoase și mai zgomotoase, sunt necesare programe speciale de analiză.

• Noi algoritmi (de exemplu, Minimap2 și Mapquik) au fost optimizați pentru aceste date.

• Volumul mare de date poate pune presiune financiară asupra centrelor de cercetare, din perspectiva infrastructurii de stocare și analiză.

Ce se așteaptă în viitor?

• Secvențierea PacBio HiFi este ideală pentru SNV și fazare; ONT are avantaje privind lungimea și viteza.

• Pe măsură ce prețurile scad și precizia crește, integrarea în practica clinică se va accelera.

• Hărțile complete ale genomului individual vor deveni mai răspândite, în locul genomului de referință.

• Informațiile despre genom, epigenom și transcriptom vor putea fi prezentate împreună.

Concluzie: tehnologiile cu citiri lungi deschid o nouă eră în tratamentul cancerului

Acum este posibilă nu doar detectarea variantelor genetice, ci și înțelegerea lor în context. Tehnologiile de secvențiere cu citiri lungi ne permit să înțelegem mai cuprinzător baza biologică a cancerului și să dezvoltăm mai precis abordări terapeutice personalizate. Acest progres revoluționar pare că își va găsi locul, în viitorul apropiat, nu doar în laboratoarele de cercetare, ci și în cabinetele clinice.