Расшифровка генетической карты рака: новые технологии секвенирования длинных прочтений

Зачем нужны новые технологии секвенирования?

Рак возникает из сложного сочетания генетических мутаций и развивается по законам клеточной эволюции. Большинство генетических анализов, использовавшихся до сих пор при лечении миллионов онкологических пациентов, основано на секвенировании коротких прочтений (short-read). Однако эта технология серьезно ограничена в выявлении сложных генетических перестроек и крупных структурных изменений. Здесь на помощь приходит секвенирование третьего поколения (Third Generation Sequencing, TGS), также называемое секвенированием длинных прочтений (Long-Read Sequencing, LRS).

Новые технологии, особенно платформы PacBio и Oxford Nanopore (ONT), позволяют точнее и полнее исследовать сложные участки генома, эпигенетические изменения и полную структуру транскриптома. В статье мы подробно рассматриваем, почему секвенирование длинных прочтений стало революционным достижением в исследованиях рака и где проявляются его преимущества.

ПРИМЕЧАНИЕ: эпигенетические изменения— химические модификации, влияющие на работу генов без изменения последовательности ДНК, например метилирование ДНК. Полная структура транскриптома — совокупность всех активно экспрессируемых в клетке молекул РНК, особенно изоформ мРНК. Анализ этих компонентов помогает понять изменения экспрессии генов при таких заболеваниях, как рак, и реакцию клеток на внешние воздействия.
Кроме того, он играет ключевую роль в разработке таргетного лечения и поиске биомаркеров.

Ограничения коротких прочтений: где NGS сталкивается с трудностями?

Разработанные после начала нового тысячелетия технологии секвенирования коротких прочтений (Next-Generation Sequencing, NGS)позволяют получать генетическую информацию, секвенируя короткие фрагменты ДНК миллиарды раз . Однако длина прочтения обычно ограничена несколькими сотнями пар оснований. Поэтому технология недостаточно эффективна для:

• Выявления сложных структурных вариантов (SV),

• Сборки генома (assembly),

• Анализа транскриптома, например вариантов сплайсинга РНК,

• Прямого обнаружения эпигенетических модификаций.

Например, при секвенировании РНК с помощью NGS ошибки ПЦР-амплификации и недостаточное число прочтений в GC-богатых участках могут нарушать полноту результатов.

Таблица 1.Преимущества и недостатки технологий длинных и коротких прочтений.

Что такое секвенирование длинных прочтений и почему оно важно?

Технологии TGS/LRS — платформы, считывающие молекулы ДНК или РНК гораздо более длинными фрагментами. Длина прочтений обычно превышает 10000 bp, а иногда достигает 2 миллионов оснований. Благодаря этому можно анализировать:

• Сложные геномные перестройки,

• Полноразмерные транскрипты мРНК,

• Эпигенетические изменения, например метилирование ДНК,

• Фазирование (phasing) на уровне отдельных клеток и множество других деталей, ранее недоступных для NGS.

Теперь вместо выравнивания прочтений на референсный геном эта технология позволяет создавать полные индивидуальные сборки генома.

Что предлагает каждая технология?

Ограничения традиционного секвенирования коротких прочтений (NGS) заставили ученых искать новые решения для более полного и точного анализа. Технологии третьего поколения (TGS) предлагают инструменты, способные революционизировать анализ и генома, и транскриптома. Ниже приведена схема работы трех наиболее распространенных платформ и их основных различий:

A) Технология секвенирования PacBio HiFi: Платформа PacBio соединяет фрагменты ДНК специальными адаптерами, похожими на «шпильки», создавая кольцевую структуру SMRTbell . Ее загружают в ячейку SMRT, и одну молекулу ДНК последовательно считывают много раз. Ошибки исправляют алгоритмами кругового консенсуса, получая итоговое прочтение с высокой точностью.

(B) Технология секвенирования Oxford Nanopore (ONT): На платформе ONT концы ДНК маркируют адаптерами с моторным белком. Одиночная молекула проходит через нанопору, и каждое основание вызывает характерное изменение электрического тока. Измерения позволяют восстановить генетическую последовательность. Преимущества — работа в реальном времени и возможность сверхдлинных прочтений.

(C) Технология секвенирования Illumina (короткие прочтения): В системе Illumina ДНК делят на небольшие фрагменты и маркируют адаптерами. После подготовки библиотеки каждую молекулу ДНК секвенируют, получая множество коротких прочтений. Технология обеспечивает высокую точность и производительность, но ограничена по длине и сложности.

В каких областях длинные прочтения дают преимущество?

1. Выявление точечных мутаций и их фазового расположения при раке

• Как показывает пример EGFR, расположение мутаций L858R и T790M на определенных аллелях имеет ключевое значение для ответа на лечение.

• PacBio и ONT позволяют фазировать эти мутации на уровне одного аллеля.

• Фазирование помогает прогнозировать, какой пациент получит пользу от определенной таргетной терапии.

2. Подробное картирование структурных вариантов (SV)

• Показано, что 55% драйверных мутаций при раке относятся к SV.

• В исследованиях с PacBio обнаружены более 20000 SV, не выявляемых короткими прочтениями .

• В частности, лучше изучаются такие события, как делеции генов-супрессоров опухолей и увеличение числа копий онкогенов.

3. Выявление новых генных слияний

• Помимо известных слияний RET, ALK и ROS1, можно определять и новые.

• С помощью ONT в образцах, обогащенных CRISPR–Cas9, генные слияния удалось выявить менее чем за 24 часа.

4. Анализ полноразмерного транскриптома

• Исследования рака желудка и колоректального рака выявили более 60% ранее неизвестных изоформ.

• Эти изоформы перспективны для поиска новых биомаркеров и терапевтических мишеней.

5. Метилирование ДНК и эпигенетический анализ

• TGS позволяет непосредственно считывать метилирование, например 5-mC и 6-mA, без химической обработки.

• При опухолях мозга профиль метилирования интраоперационных образцов был получен за 2 часа, обеспечив диагностику в реальном времени.

6. Жидкостная биопсия и анализ cfDNA

• В отличие от NGS, для анализа, дающего результат за 24 часа, может быть достаточно низкого покрытия; результаты можно получать в реальном времени.

• Мутации TP53 выявляются даже при частоте мутации всего 0,02%.

• Показано, что длинные фрагменты cfDNA также могут нести опухолеспецифичную информацию.

Таблица 2.Сводка сложности данных TGS и NGS.

Биоинформатические трудности и взгляд в будущее

• Поскольку данные длинных прочтений объемнее и содержат больше шума, необходимы специальные программы анализа.

• Новые алгоритмы, например Minimap2 и Mapquik, оптимизированы для этих данных.

• Большой объем данных может создавать для исследовательских центров финансовую нагрузку на хранение и вычислительную инфраструктуру.

Чего ожидают в будущем?

• Секвенирование PacBio HiFi идеально подходит для SNV и фазирования; ONT имеет преимущества по длине и скорости.

• По мере снижения цен и повышения точности интеграция в клиническую практику ускорится.

• Полные индивидуальные карты генома будут все чаще использоваться вместо референсного генома.

• Вместе с геномом можно будет представлять информацию об эпигеноме и транскриптоме.

Заключение: длинные прочтения открывают новую эру в лечении рака

Теперь можно не только выявлять генетические варианты, но и понимать их в контексте. Технологии секвенирования длинных прочтений позволяют целостнее изучать биологическую основу рака и точнее разрабатывать персонализированное лечение. Это революционное достижение, вероятно, в ближайшем будущем займет место не только в исследовательских лабораториях, но и в клинических кабинетах.