Xərçəngin genetik xəritəsini açmaq: yeni nəsil uzun oxuma sekvensləmə texnologiyaları

Nə üçün yeni sekvensləmə texnologiyalarına ehtiyacımız var?

Xərçəng genetik mutasiyaların mürəkkəb birləşməsindən yaranan və hüceyrə təkamülü qanunlarına uyğun irəliləyən xəstəlikdir. İndiyədək milyonlarla xərçəng xəstəsinin müalicəsində istifadə olunan genetik analizlərin çoxu qısa oxuma (short-read) sekvensləmə texnologiyalarına əsaslanır. Lakin bu texnologiya xüsusən mürəkkəb genetik yenidənqurulmaları və irimiqyaslı struktur dəyişikliklərini aşkar etməkdə ciddi məhdudiyyətlərə malikdir. Məhz burada üçüncü nəsil sekvensləmə (Third Generation Sequencing — TGS), başqa adı ilə uzun oxuma sekvensləməsi (Long-Read Sequencing — LRS) işə düşür.

Yeni texnologiyalar, xüsusən PacBio və Oxford Nanopore (ONT) kimi platformalar sayəsində genomun mürəkkəb sahələri, epigenetik dəyişikliklər və tam transkriptom quruluşu artıq daha düzgün və əhatəli araşdırıla bilir. Bu məqalədə uzun oxuma sekvensləməsinin xərçəng tədqiqatlarında nə üçün inqilabi yenilik olduğunu və hansı sahələrdə önə çıxdığını hərtərəfli nəzərdən keçirəcəyik.

QEYD: Epigenetik dəyişikliklər DNA ardıcıllığı dəyişmədən genlərin necə işlədiyinə təsir edən kimyəvi modifikasiyalardır (məsələn, DNA metilləşməsi). Tam transkriptom quruluşu isə hüceyrədə aktiv ifadə olunan bütün RNA molekullarının (xüsusən mRNA izoformlarının) toplusudur. Bunların təhlili xərçəng kimi xəstəliklərdə gen ifadəsinin necə dəyişdiyini və hüceyrələrin ətraf mühit təsirlərinə necə cavab verdiyini anlamağa kömək edir.
Həmçinin hədəfə yönəlmiş müalicələrin hazırlanmasında və biomarkerlərin kəşfində mühüm rol oynayır.

Qısa oxuma sekvensləməsinin məhdudiyyətləri: NGS harada çətinlik çəkir?

Yeni minillikdən sonra hazırlanmış qısa oxuma sekvensləmə texnologiyaları (Next-Generation Sequencing — NGS)qısa DNA parçalarını milyardlarla dəfə sekvensləyərək genetik məlumatı üzə çıxara bilir. Lakin oxuma uzunluğu adətən yalnız bir neçə yüz baza cütü ilə məhduddur. Bu da aşağıdakı sahələrdə:

• mürəkkəb struktur variantların (SV) aşkarlanması,

• genomun yığılması (assembly),

• RNA splaysinq variantları kimi transkriptom analizləri,

• epigenetik modifikasiyaların birbaşa müəyyən edilməsi baxımından kifayət etməməsinə səbəb olur.

Məsələn, NGS ilə RNA sekvensləməsində PCR amplifikasiyasının gətirdiyi xətalar və GC ilə zəngin sahələrdə oxumaların azlığı nəticələrin bütövlüyünə mənfi təsir edə bilər.

Cədvəl 1.Uzun və qısa oxuma texnologiyalarının üstünlük və çatışmazlıqlarının xülasəsi.

Uzun oxuma sekvensləməsi nədir və nə üçün vacibdir?

TGS/LRS texnologiyaları DNA və ya RNA molekullarını daha uzun parçalar şəklində oxuya bilən platformalardır. Adətən 10000 bp-dən çox, bəzi oxumalarda hətta 2 milyon bazayadək uzunluq əldə edilə bilir. Bunun sayəsində:

• mürəkkəb genomik yenidənqurulmalar,

• tam uzunluqlu mRNA transkriptləri,

• epigenetik dəyişikliklər (məsələn, DNA metilləşməsi),

• tək hüceyrə səviyyəsində fazalaşdırma (phasing) kimi əvvəllər NGS ilə əldə olunmayan bir çox təfərrüat təhlil edilə bilir.

Bu texnologiyanın oxumaları ilə artıq referens genoma uyğunlaşdırma əvəzinə şəxsə xas tam genom yığımları yaratmaq mümkün olur.

Hansı texnologiya nə təklif edir?

Ənənəvi qısa oxuma sekvensləmə texnologiyalarının (NGS) məhdudiyyətləri alimləri daha əhatəli və düzgün analiz edə bilən yeni həllərə yönəldib. Üçüncü nəsil sekvensləmə texnologiyaları (TGS) həm genom, həm də transkriptom analizində inqilab yaradacaq qədər güclü alətlər təqdim edir. Aşağıda ən çox istifadə olunan üç platformanın necə işlədiyini və hansı cəhətlərdən fərqləndiyini göstərən xülasə sxem var:

A) PacBio HiFi sekvensləmə texnologiyası: PacBio platforması DNA parçalarını xüsusi “saç sancağına bənzər” adaptorlarla birləşdirərək SMRTbell adlanan dairəvi struktur yaradır. Bu struktur SMRT hüceyrəsinə yüklənir və eyni DNA molekulu ardıcıl olaraq çox dəfə oxunur. Oxumalardakı xətalar dairəvi konsensus alqoritmləri ilə düzəldilir və yüksək dəqiqlikli yekun oxuma alınır.

(B) Oxford Nanopore (ONT) sekvensləmə texnologiyası: ONT platformasında DNA uclarına yerləşdirilmiş motor zülallı adaptorlarla işarələnir. Tək DNA molekulu nanopordan keçirilir və hər baza özünəməxsus elektrik cərəyanı dəyişikliyi yaradır. Bu dəyişikliklər ölçülərək genetik ardıcıllıq müəyyən edilir. Real vaxtda sekvensləmə və ultra uzun oxuma qabiliyyəti ilə seçilir.

(C) Illumina (qısa oxuma) sekvensləmə texnologiyası: Illumina sistemində DNA kiçik parçalara ayrılır və adaptorlarla işarələnir. Kitabxana hazırlandıqdan sonra hər DNA molekulu sekvenslənir və çoxlu qısa oxuma alınır. Texnologiya yüksək dəqiqlik və məhsuldarlıqla işləsə də, uzunluq və mürəkkəblik baxımından məhduddur.

Uzun oxuma sekvensləməsi harada fərq yaradır?

1. Xərçəngdə nöqtə mutasiyalarının və faza vəziyyətlərinin aşkarlanması

• EGFR mutasiyaları nümunəsində olduğu kimi, L858R və T790M mutasiyalarının hansı alleldə olması müalicəyə cavab baxımından mühüm əhəmiyyət daşıyır.

• PacBio və ONT bu mutasiyaları tək allel səviyyəsində fazalaşdıra bilir.

• Faza analizi hansı xəstənin hansı hədəfə yönəlmiş müalicədən faydalanacağını proqnozlaşdırmağa imkan verir.

2. Struktur variantların (SV) ətraflı xəritələnməsi

• Xərçəngdə sürücü mutasiyaların 55%-nin SV olduğu göstərilib.

• PacBio ilə aparılan tədqiqatlarda qısa oxuma ilə aşkarlanmayan 20000-dən çox SV kəşf edilib.

• Xüsusən şiş supressor genlərinin silinməsi və ya onkogenlərin çoxalması kimi hadisələr daha yaxşı anlaşılır.

3. Yeni gen füziyalarının müəyyən edilməsi

• RET, ALK və ROS1 kimi məlum füziyalardan başqa yeni füziyaları da müəyyən etmək mümkündür.

• ONT ilə 24 saatdan az müddətdə CRISPR–Cas9 ilə zənginləşdirilmiş nümunələrdə gen füziyaları aşkarlanıb.

4. Tam uzunluqlu transkriptom analizi

• Mədə və kolorektal xərçənglərdə aparılan tədqiqatlar əvvəllər məlum olmayan 60%-dən çox izoformu üzə çıxarıb.

• Bu izoformlar yeni biomarkerlərin və müalicə hədəflərinin müəyyən edilməsi üçün ümidvericidir.

5. DNA metilləşməsi və epigenetik analizlər

• TGS ilə 5-mC və 6-mA kimi metilləşmələr kimyəvi emal tələb olunmadan birbaşa oxuna bilir.

• Beyin şişlərində əməliyyat zamanı alınmış nümunələrdən 2 saat ərzində metilləşmə profili çıxarılaraq real vaxt diaqnostikası təmin edilib.

6. Maye biopsiya və cfDNA analizi

• NGS-dən fərqli olaraq, 24 saatda nəticələnən tətbiqdə aşağı örtülmə kifayət edə və real vaxtda nəticə verilə bilər.

• Hətta 0,02% kimi aşağı mutasiya tezliklərində TP53 mutasiyaları aşkarlana bilir.

• cfDNA-nın uzun fraqmentlərinin də şişə xas məlumat daşıya bildiyi göstərilib.

Cədvəl 2.TGS və NGS-də məlumat mürəkkəbliyinin xülasəsi.

Bioinformatik çətinliklər və gələcəyə baxış

• Uzun oxuma məlumatları daha böyük həcmli və küylü olduğundan xüsusi analiz proqramlarına ehtiyac duyulur.

• Yeni alqoritmlər (məsələn, Minimap2, Mapquik) bu məlumatlar üçün optimallaşdırılıb.

• Böyük məlumat həcmi saxlama və analiz infrastrukturu baxımından tədqiqat mərkəzlərinə maliyyə yükü yarada bilər.

Gələcəkdə nə gözlənilir?

• PacBio HiFi sekvensləməsi SNV və fazalaşdırma üçün idealdır; ONT isə uzunluq və sürət baxımından üstünlük verir.

• Qiymətlər azaldıqca və dəqiqlik artdıqca klinik praktikaya inteqrasiyası sürətlənəcək.

• Referens genom əvəzinə şəxsə xas tam genom xəritələri geniş yayılacaq.

• Genomla yanaşı epigenom və transkriptom məlumatları birlikdə təqdim edilə biləcək.

Nəticə: uzun oxuma texnologiyaları xərçəng müalicəsində yeni dövr açır

Artıq genetik variantları yalnız aşkarlamaq deyil, kontekstdə mənalandırmaq mümkündür. Uzun oxuma sekvensləmə texnologiyaları xərçəngin bioloji əsasını daha bütöv anlamağa və fərdiləşdirilmiş müalicə yanaşmalarını daha düzgün hazırlamağa imkan verir. Bu inqilabi yeniliyin yaxın gələcəkdə yalnız tədqiqat laboratoriyalarında deyil, klinik kabinetlərdə də yer alacağı görünür.