Die genetische Landkarte von Krebs entschlüsseln: Neue Technologien der Long-Read-Sequenzierung

Warum brauchen wir neue Sequenzierungstechnologien?

Krebs entsteht aus einem komplexen Zusammenspiel genetischer Mutationen und entwickelt sich nach den Gesetzmäßigkeiten der zellulären Evolution weiter. Die meisten genetischen Analysen, die bislang bei der Behandlung von Millionen Menschen mit Krebs eingesetzt wurden, beruhen auf der Short-Read-Sequenzierung. Diese Technologie hat jedoch erhebliche Grenzen, insbesondere bei der Erkennung komplexer genetischer Umlagerungen und großräumiger struktureller Veränderungen. Hier kommt die Sequenzierung der dritten Generation (Third Generation Sequencing, TGS), auch Long-Read-Sequenzierung (LRS) genannt, ins Spiel.

Dank neuer Technologien, insbesondere Plattformen wie PacBio und Oxford Nanopore (ONT), lassen sich komplexe Genomregionen, epigenetische Veränderungen und die vollständige Struktur des Transkriptoms heute genauer und umfassender untersuchen. Dieser Artikel erläutert ausführlich, warum die Long-Read-Sequenzierung einen revolutionären Fortschritt für die Krebsforschung darstellt und in welchen Bereichen sie besonders wichtig ist.

HINWEIS: Epigenetische Veränderungen sind chemische Modifikationen, die die Aktivität von Genen beeinflussen, ohne die DNA-Sequenz zu verändern, beispielsweise die DNA-Methylierung. Die vollständige Struktur des Transkriptoms umfasst dagegen sämtliche in einer Zelle aktiv exprimierten RNA-Moleküle, insbesondere die mRNA-Isoformen. Ihre Analyse hilft zu verstehen, wie sich die Genexpression bei Erkrankungen wie Krebs verändert und wie Zellen auf Umwelteinflüsse reagieren.
Außerdem spielt sie eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung zielgerichteter Behandlungen und der Entdeckung von Biomarkern.

Grenzen der Short-Read-Sequenzierung: Wo stößt NGS an Grenzen?

Die nach der Jahrtausendwende entwickelten Short-Read-Sequenzierungstechnologien (Next-Generation Sequencing, NGS) erschließen genetische Informationen, indem sie kurze DNA-Fragmente milliardenfach sequenzieren . Die Leselänge ist jedoch meist auf wenige Hundert Basenpaare begrenzt. Das führt zu Einschränkungen bei:

• der Erkennung komplexer struktureller Varianten (SV),

• der Genomassemblierung (Assembly),

• Transkriptomanalysen, etwa von RNA-Spleißvarianten,

• der direkten Erkennung epigenetischer Modifikationen.

So können bei RNA-Sequenzierungen mit NGS Fehler durch die PCR-Amplifikation und eine geringe Zahl von Reads in GC-reichen Regionen die Vollständigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen.

Tabelle 1.Übersicht über die Vor- und Nachteile von Long-Read- und Short-Read-Technologien.

Was ist Long-Read-Sequenzierung und warum ist sie wichtig?

TGS-/LRS-Technologien können DNA- oder RNA-Moleküle in wesentlich längeren Abschnitten lesen. Üblicherweise werden Leselängen von über 10.000 bp erreicht, einzelne Reads können sogar bis zu 2 Millionen Basen umfassen. Dadurch lassen sich zahlreiche Details analysieren, die mit NGS zuvor nicht zugänglich waren, darunter:

• komplexe genomische Umlagerungen,

• mRNA-Transkripte in voller Länge,

• epigenetische Veränderungen, beispielsweise DNA-Methylierung,

• Phasenanalysen (Phasing) auf Einzelzellebene .

Mit dieser Technologie lassen sich nun individuelle vollständige Genomassemblierungen erstellen, anstatt die Reads lediglich an einem Referenzgenom auszurichten.

Welche Technologie bietet was?

Die Grenzen herkömmlicher Short-Read-Sequenzierungstechnologien (NGS) haben die Wissenschaft dazu veranlasst, nach neuen Lösungen für umfassendere und präzisere Analysen zu suchen. Sequenzierungstechnologien der dritten Generation (TGS) bieten leistungsstarke Werkzeuge, die sowohl Genom- als auch Transkriptomanalysen revolutionieren können. Das folgende Schema zeigt zusammenfassend, wie die drei am häufigsten verwendeten Plattformen funktionieren und worin sie sich unterscheiden:

A) PacBio-HiFi-Sequenzierung: Die PacBio-Plattform verbindet DNA-Fragmente mit speziellen „haarnadelförmigen“ Adaptern zu einer SMRTbell genannten ringförmigen Struktur. Diese wird in eine SMRT-Zelle eingebracht, in der dasselbe DNA-Molekül mehrfach nacheinander gelesen wird. Fehler in diesen Reads werden durch Algorithmen zur zirkulären Konsensusbildung korrigiert, sodass ein endgültiger Read mit hoher Genauigkeit entsteht.

(B) Oxford-Nanopore-Sequenzierung (ONT): Bei der ONT-Plattform wird die DNA mit Adaptern markiert, die an den Enden Motorproteine enthalten. Ein einzelnes DNA-Molekül wird durch eine Nanopore geführt. Jede Base verursacht dabei eine charakteristische Änderung des elektrischen Stroms. Durch die Messung dieser Veränderungen wird die genetische Sequenz bestimmt. Die Technologie zeichnet sich durch Sequenzierung in Echtzeit und ultralange Reads aus.

(C) Illumina-Sequenzierung (Short Reads): Im Illumina-System wird die DNA in kleine Fragmente zerlegt und mit Adaptern markiert. Nach der Herstellung der Bibliothek wird jedes DNA-Molekül sequenziert, wodurch zahlreiche kurze Reads entstehen. Diese Technologie arbeitet mit hoher Genauigkeit und hohem Durchsatz, ist jedoch hinsichtlich Leselänge und Komplexität begrenzt.

Wo macht Long-Read-Sequenzierung einen Unterschied?

1. Erkennung von Punktmutationen und ihrer Phasenlage bei Krebs

• Wie das Beispiel der EGFR-Mutationen L858R und T790M zeigt, ist es für das Therapieansprechen entscheidend, auf welchem Allel sich die jeweiligen Mutationen befinden.

• PacBio und ONT können die Phasenlage dieser Mutationen auf Ebene eines einzelnen Allels bestimmen.

• Die Phasenanalyse ermöglicht Vorhersagen darüber, welche Betroffenen von welcher zielgerichteten Behandlung profitieren könnten.

2. Detaillierte Kartierung struktureller Varianten (SV)

• Es wurde gezeigt, dass 55% der Treibermutationen bei Krebs strukturelle Varianten sind.

• In Studien mit PacBio wurden mehr als 20.000 SV entdeckt, die mit Short Reads nicht erkennbar waren .

• Insbesondere Vorgänge wie die Deletion von Tumorsuppressorgenen oder die Vervielfältigung von Onkogenen lassen sich dadurch besser verstehen.

3. Identifizierung neuer Genfusionen

• Neben bekannten Fusionen wie RET, ALK und ROS1 lassen sich auch neue Fusionen identifizieren.

• Mit ONT konnten in durch CRISPR–Cas9 angereicherten Proben Genfusionen in weniger als 24 Stunden erkannt werden.

4. Transkriptomanalyse in voller Länge

• Studien bei Magen- und Darmkrebs identifizierten mehr als 60% zuvor unbekannte Isoformen.

• Diese Isoformen sind vielversprechend für die Identifizierung neuer Biomarker und therapeutischer Angriffspunkte.

5. DNA-Methylierung und epigenetische Analysen

• Mit TGS lassen sich Methylierungen wie 5-mC und 6-mA direkt und ohne chemische Behandlung auslesen.

• Bei Hirntumoren ermöglichten Methylierungsprofile aus intraoperativ gewonnenen Proben innerhalb von 2 Stunden eine Diagnose in Echtzeit.

6. Flüssigbiopsie / Liquid Biopsy und cfDNA-Analyse

• Im Gegensatz zu NGS kann bei dieser Anwendung, die innerhalb von 24 Stunden Ergebnisse liefert, eine geringe Abdeckung ausreichen und eine Auswertung in Echtzeit möglich sein.

• TP53-Mutationen lassen sich selbst bei Mutationsfrequenzen von nur 0,02% nachweisen.

• Es wurde gezeigt, dass auch lange cfDNA-Fragmente tumorspezifische Informationen enthalten können.

Tabelle 2.Übersicht über die Datenkomplexität bei TGS und NGS.

Bioinformatische Herausforderungen und Ausblick

• Da Long-Read-Daten umfangreicher und stärker verrauscht sind, wird spezielle Analysesoftware benötigt.

• Neue Algorithmen, etwa Minimap2 und Mapquik, wurden für diese Daten optimiert.

• Die großen Datenmengen können Forschungszentren durch die erforderliche Speicher- und Analyseinfrastruktur finanziell belasten.

Was ist künftig zu erwarten?

• PacBio-HiFi-Sequenzierung eignet sich besonders für SNV und Phasing; ONT bietet dagegen Vorteile bei Leselänge und Geschwindigkeit.

• Mit sinkenden Preisen und steigender Genauigkeit wird sich die Integration in die klinische Praxis beschleunigen.

• Individuelle vollständige Genomkarten werden anstelle eines Referenzgenoms zunehmend Verbreitung finden.

• Informationen über Genom, Epigenom und Transkriptom werden gemeinsam bereitgestellt werden können.

Fazit: Long-Read-Technologien eröffnen eine neue Ära der Krebsbehandlung

Genetische Varianten lassen sich heute nicht nur erkennen, sondern auch in ihrem Zusammenhang verstehen. Long-Read-Sequenzierungstechnologien ermöglichen ein umfassenderes Verständnis der biologischen Grundlagen von Krebs und eine präzisere Entwicklung personalisierter Behandlungsansätze. Dieser revolutionäre Fortschritt dürfte in naher Zukunft nicht nur in Forschungslaboren, sondern auch in der klinischen Praxis Einzug halten.