კიბოს გენეტიკური რუკის გაშიფვრა: ახალი თაობის გრძელი წაკითხვის სეკვენირების ტექნოლოგიები

რატომ გვჭირდება სეკვენირების ახალი ტექნოლოგიები?

კიბო დაავადებაა, რომელიც გენეტიკური მუტაციების რთული ერთობლიობიდან წარმოიქმნება და უჯრედული ევოლუციის კანონების მიხედვით პროგრესირებს. დღემდე მილიონობით კიბოს მქონე პაციენტის მკურნალობაში გამოყენებული გენეტიკური ანალიზების უმეტესობა მოკლე წაკითხვის (short-read) სეკვენირების ტექნოლოგიებს ეფუძნება. თუმცა ამ ტექნოლოგიას სერიოზული შეზღუდვები აქვს, განსაკუთრებით რთული გენეტიკური გადაწყობებისა და მასშტაბური სტრუქტურული ცვლილებების გამოვლენისას. სწორედ აქ შემოდის მესამე თაობის სეკვენირება (Third Generation Sequencing - TGS), რომელსაც გრძელი წაკითხვის სეკვენირებასაც (Long-Read Sequencing - LRS) უწოდებენ.

ახალი ტექნოლოგიებით, განსაკუთრებით ისეთი პლატფორმებით, როგორიცაა PacBio და Oxford Nanopore (ONT), ახლა გენომის რთული უბნების, ეპიგენეტიკური ცვლილებებისა და სრული ტრანსკრიპტომის სტრუქტურის უფრო ზუსტად და სრულყოფილად შესწავლა შეიძლება. ამ სტატიაში დეტალურად განვიხილავთ, რატომ არის გრძელი წაკითხვის სეკვენირება რევოლუციური წინსვლა კიბოს კვლევაში და რომელ სფეროებში გამოირჩევა იგი.

შენიშვნა: ეპიგენეტიკური ცვლილებები ქიმიური მოდიფიკაციებია, რომლებიც DNA-ს მიმდევრობის შეცვლის გარეშე გენების მუშაობაზე მოქმედებს (მაგალითად, DNA-ს მეთილაცია). სრული ტრანსკრიპტომის სტრუქტურა კი უჯრედში აქტიურად ექსპრესირებული RNA-ს ყველა მოლეკულის (განსაკუთრებით mRNA იზოფორმების) ერთობლიობაა. ამ კომპონენტების ანალიზი გვეხმარება გავიგოთ, როგორ იცვლება გენების ექსპრესია ისეთი დაავადებების დროს, როგორიცაა კიბო, და როგორ პასუხობენ უჯრედები გარემოს ზემოქმედებას.
ამასთან, იგი კრიტიკულ როლს ასრულებს სამიზნე მკურნალობების შემუშავებასა და ბიომარკერების აღმოჩენაში.

მოკლე წაკითხვის სეკვენირების შეზღუდვები: სად ფერხდება NGS?

მილენიუმის შემდეგ შემუშავებულ მოკლე წაკითხვის სეკვენირების ტექნოლოგიებს (Next-Generation Sequencing - NGS) DNA-ს მოკლე მონაკვეთების მილიარდჯერ სეკვენირებით გენეტიკური ინფორმაციის გამოვლენა შეუძლია. თუმცა წაკითხვის სიგრძე, ჩვეულებრივ, მხოლოდ რამდენიმე ასეული ფუძეთა წყვილით შემოიფარგლება. ამიტომ ისინი არასაკმარისია შემდეგ საკითხებში:

• რთული სტრუქტურული ვარიანტების (SV) გამოვლენა,

• გენომის აწყობა (assembly),

• ტრანსკრიპტომის ანალიზი, მაგალითად RNA-ს სპლაისინგის ვარიანტების შესწავლა,

• ეპიგენეტიკური მოდიფიკაციების პირდაპირი გამოვლენა.

მაგალითად, NGS-ით RNA-ს სეკვენირებისას PCR ამპლიფიკაციით წარმოქმნილმა შეცდომებმა და GC-ით მდიდარ უბნებში წაკითხვების სიმცირემ შესაძლოა შედეგების სისრულეზე უარყოფითად იმოქმედოს.

ცხრილი 1. გრძელი და მოკლე წაკითხვის ტექნოლოგიების უპირატესობებისა და ნაკლოვანებების შეჯამება.

რა არის გრძელი წაკითხვის სეკვენირება და რატომ არის მნიშვნელოვანი?

TGS/LRS ტექნოლოგიები პლატფორმებია, რომლებსაც DNA-ს ან RNA-ს მოლეკულების გაცილებით გრძელი მონაკვეთების წაკითხვა შეუძლია. ჩვეულებრივ, მიიღება 10000 bp-ზე მეტი სიგრძის წაკითხვები, ზოგჯერ კი მათი სიგრძე 2 მილიონ ფუძემდეც აღწევს. ამის წყალობით შესაძლებელია შემდეგი დეტალების ანალიზი:

• რთული გენომური გადაწყობები,

• სრული სიგრძის mRNA ტრანსკრიპტები,

• ეპიგენეტიკური ცვლილებები (მაგალითად, DNA-ს მეთილაცია),

• ერთუჯრედულ დონეზე ფაზირების ანალიზი (phasing) და მრავალი სხვა დეტალი, რომელიც ადრე NGS-ით მიუწვდომელი იყო.

ამ ტექნოლოგიით მიღებული წაკითხვები ახლა შესაძლებელს ხდის რეფერენსულ გენომთან გასწორების ნაცვლად ინდივიდის სრული გენომის აწყობას.

რომელი ტექნოლოგია რას გვთავაზობს?

მოკლე წაკითხვის ტრადიციული სეკვენირების ტექნოლოგიების (NGS) შეზღუდვებმა მეცნიერები უფრო სრულყოფილი და ზუსტი ანალიზის ახალი გადაწყვეტებისკენ მიმართა. მესამე თაობის სეკვენირების ტექნოლოგიები (TGS) ისეთი ძლიერი ხელსაწყოებია, რომ გენომისა და ტრანსკრიპტომის ანალიზში რევოლუცია შეუძლიათ. ქვემოთ მოცემულია შემაჯამებელი სქემა, რომელიც გვიჩვენებს, როგორ მუშაობს სამი ყველაზე გავრცელებული პლატფორმა და რით განსხვავდებიან ისინი ერთმანეთისგან:

A) PacBio HiFi სეკვენირების ტექნოლოგია: PacBio პლატფორმა DNA-ს ფრაგმენტებს სპეციალური „თმის სარჭის მსგავსი“ ადაპტერებით აერთიანებს და SMRTbell სახელწოდების წრიულ სტრუქტურას ქმნის. ეს სტრუქტურა SMRT უჯრედში თავსდება და ერთი და იგივე DNA-ს მოლეკულა მრავალჯერ ზედიზედ იკითხება. წაკითხვების შეცდომები წრიული კონსენსუსის ალგორითმებით სწორდება და მაღალი სიზუსტის საბოლოო წაკითხვა მიიღება.

(B) Oxford Nanopore (ONT) სეკვენირების ტექნოლოგია: ONT პლატფორმაზე DNA ინიშნება მის ბოლოებზე მიმაგრებული, მოტორული ცილის შემცველი ადაპტერებით. DNA-ს ერთი მოლეკულა ნანოფორში გადის და თითოეული ფუძე ელექტრული დენის მისთვის დამახასიათებელ ცვლილებას იწვევს. ამ ცვლილებების გაზომვით გენეტიკური მიმდევრობა იშიფრება. იგი რეალურ დროში სეკვენირებისა და ულტრაგრძელი წაკითხვის შესაძლებლობით გამოირჩევა.

(C) Illumina-ს (მოკლე წაკითხვის) სეკვენირების ტექნოლოგია: Illumina-ს სისტემაში DNA მცირე ფრაგმენტებად იყოფა და ადაპტერებით ინიშნება. ბიბლიოთეკის მომზადების შემდეგ DNA-ს თითოეული მოლეკულა სეკვენირდება და მრავალი მოკლე წაკითხვა მიიღება. მიუხედავად მაღალი სიზუსტისა და წარმადობისა, ეს ტექნოლოგია სიგრძისა და სირთულის მხრივ შეზღუდულია.

სად ქმნის განსხვავებას გრძელი წაკითხვის სეკვენირება?

1. კიბოს დროს წერტილოვანი მუტაციებისა და ფაზირების სტატუსის გამოვლენა

• EGFR მუტაციების მაგალითზე, მკურნალობაზე პასუხისთვის კრიტიკულად მნიშვნელოვანია, რომელ ალელზე მდებარეობს L858R და T790M მუტაციები.

• PacBio-სა და ONT-ს ამ მუტაციების ფაზირება ცალკეული ალელის დონეზე შეუძლია.

• ფაზირების ანალიზი საშუალებას იძლევა ვიწინასწარმეტყველოთ, რომელი პაციენტი რომელი სამიზნე მკურნალობით მიიღებს სარგებელს.

2. სტრუქტურული ვარიანტების (SV) დეტალური რუკირება

• ნაჩვენებია, რომ კიბოს დრაივერი მუტაციების 55% SV-ია.

• PacBio-თი ჩატარებულ კვლევებში მოკლე წაკითხვით გამოუვლენელი 20000-ზე მეტი SV აღმოაჩინეს.

• განსაკუთრებით უკეთ გასაგები ხდება ისეთი მოვლენები, როგორიცაა სიმსივნის დამთრგუნველი გენების დელეცია ან ონკოგენების ამპლიფიკაცია.

3. გენების ახალი ფუზიების იდენტიფიცირება

• ცნობილი ფუზიების, მაგალითად RET, ALK და ROS1-ის გარდა, ახალი ფუზიების გამოვლენაც შესაძლებელია.

• ONT-ის მეშვეობით CRISPR–Cas9-ით გამდიდრებულ ნიმუშებში გენების ფუზიების გამოვლენა 24 საათზე ნაკლებ დროში მოხერხდა.

4. სრული სიგრძის ტრანსკრიპტომის ანალიზი

• კუჭისა და კოლორექტული კიბოს კვლევებმა გამოავლინა 60%-ზე მეტი მანამდე უცნობი იზოფორმა.

• ეს იზოფორმები ახალი ბიომარკერებისა და სამკურნალო სამიზნეების იდენტიფიცირებისთვის იმედისმომცემია.

5. DNA-ს მეთილაცია და ეპიგენეტიკური ანალიზები

• TGS-ით ისეთი მეთილაციების პირდაპირ წაკითხვაა შესაძლებელი, როგორიცაა 5-mC და 6-mA, ქიმიური დამუშავების გარეშე.

• ტვინის სიმსივნეებში ინტრაოპერაციული ნიმუშებიდან მეთილაციის პროფილის 2 საათში განსაზღვრით რეალურ დროში დიაგნოსტიკა მოხერხდა.

6. თხევადი ბიოფსია და cfDNA-ს ანალიზი

• NGS-ისგან განსხვავებით, 24 საათში დასრულებული პროცედურისთვის შეიძლება დაბალი დაფარვაც საკმარისი იყოს და შედეგები რეალურ დროში მიიღებოდეს.

• TP53 მუტაციების გამოვლენა 0,02%-მდე დაბალი მუტაციური სიხშირის შემთხვევაშიც შესაძლებელია.

• ნაჩვენებია, რომ cfDNA-ს გრძელ ფრაგმენტებსაც შეიძლება სიმსივნისთვის სპეციფიკური ინფორმაცია ჰქონდეთ.

ცხრილი 2. TGS-ისა და NGS-ის მონაცემთა სირთულის შეჯამება.

ბიოინფორმატიკული სირთულეები და მომავლის ხედვა

• რადგან გრძელი წაკითხვის მონაცემები უფრო მოცულობითი და ხმაურიანია, სპეციალური საანალიზო პროგრამული უზრუნველყოფაა საჭირო.

• ახალი ალგორითმები (მაგალითად, Minimap2, Mapquik) ამ მონაცემებისთვის ოპტიმიზებულია.

• მონაცემების დიდმა მოცულობამ კვლევითი ცენტრები შენახვისა და ანალიზის ინფრასტრუქტურის ხარჯებთან დაკავშირებული ზეწოლის ქვეშ შეიძლება მოაქციოს.

რას ველით მომავალში?

• PacBio HiFi სეკვენირება იდეალურია SNV-ისა და ფაზირებისთვის; ONT-ს კი სიგრძისა და სიჩქარის უპირატესობა აქვს.

• ფასების შემცირებასა და სიზუსტის ზრდასთან ერთად კლინიკურ პრაქტიკაში ინტეგრაცია დაჩქარდება.

• რეფერენსული გენომის ნაცვლად ინდივიდის სრული გენომის რუკები უფრო გავრცელდება.

• გენომთან ერთად ეპიგენომისა და ტრანსკრიპტომის ინფორმაციაც ერთობლივად იქნება წარმოდგენილი.

დასკვნა: გრძელი წაკითხვის ტექნოლოგიები კიბოს მკურნალობაში ახალ ეტაპს იწყებს

ახლა შესაძლებელია არა მხოლოდ გენეტიკური ვარიანტების აღმოჩენა, არამედ მათი კონტექსტში გააზრებაც. გრძელი წაკითხვის სეკვენირების ტექნოლოგიები კიბოს ბიოლოგიური საფუძვლების უფრო მთლიანად გაგებისა და პერსონალიზებული მკურნალობის მიდგომების უფრო ზუსტად შემუშავების საშუალებას გვაძლევს. როგორც ჩანს, ეს რევოლუციური წინსვლა ახლო მომავალში ადგილს დაიმკვიდრებს არა მხოლოდ კვლევით ლაბორატორიებში, არამედ კლინიკურ კაბინეტებშიც.