რა არის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია? PCR-ის ისტორია, ჩატარება და სამედიცინო მნიშვნელობა
ამ სტატიაში
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) DNA-ის ნაწილის ლაბორატორიაში მილიონჯერ კოპირების მეთოდია. 1983 წლის ღამის მგზავრობის იდეა ორმოც წელში გენეტიკური დიაგნოზის, კიბოს მკურნალობის, სასამართლო მედიცინისა და პანდემიის ტესტირების საფუძველი გახდა. აქ თავიდან ვხსნით და გავრცელებულ შეცდომებს წყაროებით ვასწორებთ.
წარმოიდგინეთ მკრთალი წაუკითხავი გვერდი. PCR მილიარდჯერ ასლს აკეთებს და წასაკითხს ხდის. განსხვავება: ასლის აპარატი მთელ გვერდს, PCR კი მხოლოდ მონიშნულ აბზაცს ამრავლებს. მონიშვნას პრაიმერი სახელად მოკლე სინთეზური DNA ასრულებს. ეს შერჩევითობა კოპირებიდან დიაგნოსტიკურ საშუალებად აქცევს.
ონკოლოგიაში აბსტრაქტული ტექნიკა არ არის: ძუძუს კიბოში ქიმიოთერაპიის განმსაზღვრელი 21-გენიანი RT-PCR ტესტია; ქრონიკულ მიელოიდურში პასუხი PCR-ით იზომება, HPV სკრინინგიც ეფუძნება, ფილტვში EGFR-იც. ანუ ფონის ტექნოლოგია კი არა, თვით მკურნალობის გადაწყვეტილებაა.
რა არის PCR ერთ წინადადებაში? DNA-ის ორი ბოლოთი სინთეზური პრაიმერებით შემოსაზღვრა და გათბობა-გაგრილების ციკლით, თბოგამძლე პოლიმერაზით ექსპონენციური გამრავლება. თეორიულად ყოველ ჯერზე ორმაგდება; 30 ციკლით ერთიდან დაახლოებით მილიარდი ასლი მიიღება.
როგორ მოქმედებს? სამი ნაბიჯი
მთელი პროცესი ტემპერატურის რიგით ცვლილებაა. სინჯარაში სამიზნე DNA, ორი პრაიმერი, პოლიმერაზა, ოთხი ნუკლეოტიდი (A, T, G, C) და ბუფერია. მოწყობილობა — თერმოციკლერი — ტემპერატურას ავტომატურად ცვლის.
| ნაბიჯი | ტემპერატურა | დრო | რა ხდება? |
|---|---|---|---|
| 1. დენატურაცია | 94–98 °C | 20–30 წამი | სპირალის წყალბადური ბმები წყდება და ჯაჭვები იყოფა. |
| 2. პრაიმერის შეკავშირება (ჰიბრიდიზაცია) |
50–65 °C | 20–40 წამი | პრაიმერი სამიზნის ორ ბოლოზე ჯდება და გასამრავლებელ უბანს ზღუდავს. |
| 3. დაგრძელება (ელონგაცია) |
72 °C | სიგრძით იცვლება | პოლიმერაზა პრაიმერის ბოლოდან ახალ ჯაჭვს სინთეზირებს. |
სამი ნაბიჯი 25–40-ჯერ მეორდება. ასლი თეორიულად ორმაგდება.
შესწორება: შეკავშირება „37–65 °C“ არ არის. ინტერნეტში და თურქულ წყაროებში 37 °C-დან დიაპაზონია. ეს PCR-ის პირველი, თერმომგრძნობიარე Klenow-ის 1983–1985 პერიოდს ეკუთვნის. თანამედროვე შეკავშირება პრაიმერის დნობის ტემპერატურაზე (Tm) დაახლოებით 3–5 °C-ით დაბლა ეწყობა; ტიპური 18–25 ნუკლეოტიდის Tm 55–65 °C-ია, ამიტომ პრაქტიკულად 50–65 °C. 37 °C არასწორ შეკავშირებასა და არასპეციფიკურ პროდუქტს იწვევს. ეს აკადემიური კი არა, ტესტში ცრუდადებითია.
რატომაა თბოგამძლე ფერმენტი აუცილებელი?
თავიდან პრობლემა იყო: DNA-ის გასაყოფად ყოველ ციკლში 94 °C-მდე აცხელებდნენ; DNA იყოფოდა, თუმცა ფერმენტიც ფუჭდებოდა. ყოველ დასაწყისში გახსნა და ხელით ახალი ფერმენტი იყო საჭირო. 30 ციკლი — 30 დამატება, ავტომატიზება შეუძლებელი.
გამოსავალი ცხელ წყაროს ბაქტერიიდან მოვიდა. Thermus aquaticus-ის DNA პოლიმერაზა — მოკლედ Taq პოლიმერაზა — 75–80 °C-ზე საუკეთესოდ მუშაობს, 95 °C-ზეც ნახევარდაშლა დაახლოებით 40 წუთია. Taq-ით გახსნა საჭირო აღარ იყო და პროცესი ავტომატური გახდა. ლაბორატორიული ხრიკიდან ინდუსტრიულ სტანდარტად ქცევის ნაბიჯი ესაა.
Taq-ის სისუსტეა: 3'→5' შესწორების აქტივობა არ აქვს, კოპირების შეცდომას ვერ ასწორებს. საწყისი ფერმენტის შეცდომა დაახლოებით ყოველ 9.000 ნუკლეოტიდში ერთია. დიაგნოსტიკაში ხშირად პრობლემა არაა, თუმცა სეკვენირებასა და კლონირებაში ერთი ასოც მნიშვნელოვანია და Pfu, Phusion-ის მსგავსი შესწორებიანი ფერმენტი აირჩევა. „PCR ჩატარდა“ ერთი ფერმენტისა და მეთოდის გამოყენებას არ ნიშნავს.
ისტორია — და რვა გავრცელებული შეცდომა
თურქულ წყაროებში ისტორია ძირითადად სწორია, თუმცა თარიღები და მითი მეორდება. ცხრილი წინა ვერსიასა და ინტერნეტის მტკიცებებს დადასტურებულს უდარებს.
| მტკიცება | სიმართლე |
|---|---|
| „1985-ში Erlich-მა, Mullis-მა და Saiki-მ წარადგინეს“ | სტატიას შვიდი ავტორი ჰყავს, პირველია Saiki: Saiki, Scharf, Faloona, Mullis, Horn, Erlich, Arnheim. Science 1985;230(4732):1350–1354. |
| „1966-ში Nirenberg, Khorana და Holley-მ კოდი გაშიფრეს და ხელოვნური გენი შექმნეს; Khorana-მ ნობელი ამით მიიღო“ | ნობელი 1968წელს გაიცა და მიზეზი „გენეტიკური კოდისა და ცილის სინთეზში ფუნქციის განმარტება“იყო — არა ხელოვნური გენი. პირველი სრული სინთეზი 1972წელსაა, ნობელიდან ოთხი წლის შემდეგ. |
| „1976-ში აღმოჩენილი Taq პოლიმერაზა, Thermus aquaticus-იდან მიიღეს“ | ორი მოვლენა გაერთიანდა. ბაქტერია 1969 წელს Thomas Brock-მა და Hudson Freeze-მ Yellowstone-ში იპოვეს. ფერმენტი 1976 წელს Chien-მა, Edgar-მა და Trela-მ გაასუფთავეს (J Bacteriol 1976;127:1550–1557). |
| „94 °C-ის გამძლე ფერმენტი“ | სწორია, თუმცა არასრული: Taq-ის ოპტიმუმია 75–80 °C; 95 °C-ზე ნახევარდაშლა დაახლოებით 40 წუთია, 92,5 °C-ზე 2 საათზე მეტი. |
| „სტატია დაახლოებით 15 ჟურნალმა უარყო“ | არ დასტურდება. ორი უარია დოკუმენტირებული: Nature და Science. Mullis ნობელის ლექციაში Science -ის უარს თავად ჰყვება. მეთოდი 1987 წელს Methods in Enzymology-ში გამოქვეყნდა. „15 ჟურნალს“ სანდო წყარო არ აქვს. |
| „1986-ში Taq დაემატა PCR-ს“ | Taq-PCR-ის აღწერის სტატია 1988 წლისაა: Saiki და სხვ., Science 1988;239(4839):487–491. |
| „ერთი წლის შემდეგ Perkin Elmer-მა თერმოციკლერი შექმნა“ | რიგი შებრუნებულია. Cetus-ის პროტოტიპი „Mr. Cycle“ 1985–86-ში შეიქმნა; პირველი კომერციული მოწყობილობა Perkin-Elmer Cetus-ის TC1 DNA Thermal Cyclerიყო, 1987. მოწყობილობა Taq-ის სტატიამდე ადრე მოვიდა. |
| „პრაიმერის შეკავშირება 37–65 °C“ | თანამედროვე PCR-ში 50–65 °C; Tm-ზე 3–5 °C დაბლა. 37 °C Klenow-ის 1983–85 პერიოდია. |
ყველაზე სასწავლოა მეხუთე შესწორება. „გენიოსს 15 ჟურნალმა უარი უთხრა“ საყვარელი სიუჟეტია: ბრმა სისტემა და მართალი ინდივიდი. რეალური ისტორია უფრო საინტერესოა — ორი დიდი ჟურნალი უარს ამბობს, მეთოდი მეთოდურ ჟურნალში გამოდის, მთავარი მიღწევის 1985 წლის გამოყენებითი სტატია კი უკვე Science-ში იყო. სისტემა ბრმა არ იყო; იდეა მოქმედების ჩვენებამდე დამაჯერებელი არ აღმოჩნდა. მეცნიერებაზე ეს „15 უარის“ მითზე უფრო სწორი ისტორიაა.
იდეის ღამე
Mullis-ის თქმით 1983 გაზაფხულის პარასკევის ღამით Berkeley-დან ჩრდილოეთ კალიფორნიის ქოხისკენ 128 გზატკეცილზე მოუვიდა. მანქანა გააჩერა და ქაღალდზე დაწერა. ბიოგრაფიაში აღწერს: „კალიფორნიული წაბლის ყვავილობისას“. პირველი წარმატებული ჩვენებაა 16 დეკემბერი 1983 .
არსი მარტივია: პოლიმერაზა ცნობილი იყო (1956), პრაიმერი სინთეზირდებოდა, გათბობით გაყოფაც ცნობილი იყო. ახალი მოლეკულის ნაცვლად მან სამი ცნობილი რამ ციკლში ჩასვა. აქედან ექსპონენციური გამრავლება მივიღეთ.
პირველი გამოქვეყნებული გამოყენება დიაგნოსტიკა იყო. 1985 წლის Science სტატიის თემა არა ფუნდამენტური ბიოლოგია, არამედ ნამგლისებრუჯრედოვანი ანემიის დიაგნოზიიყო: β-გლობინის გამრავლება და რესტრიქციული ანალიზი. PCR პირდაპირ კლინიკურ დიაგნოსტიკურ საშუალებად წარდგა. ორმოცი წლის შემდეგ ონკოლოგიური ადგილი ამ დასაწყისს მნიშვნელობას აძლევს.
Kary Mullis: მეთოდისა და ადამიანის გამიჯვნა
Mullis-მა 1993 ქიმიის ნობელი Michael Smith-ს გაუზიარა; Smith-მა მიმართულ მუტაგენეზში მიიღო. Mullis-ის მიზეზი იყო „პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის გამოგონება“.
შემდგომი წლები კი უსიამოვნო მაგალითია. დოკუმენტირებულად HIV-ის მიერ AIDS-ის გამოწვევას უარყოფდა — არცერთში კვლევის გამოცდილება არ ჰქონდა. აკნინებდა ანთროპოგენულ კლიმატს და ოზონის გათხელებას, მეცნიერების დაფინანსებისთვის შეთანხმებას ამტკიცებდა. ასტროლოგია სწამდა და ავტობიოგრაფიაში უცხოპლანეტელად მიჩნეულ მანათობელ მოლაპარაკე ენოტთან შეხვედრას აღწერდა. 7 აგვისტოს 2019 წელს 74 წლისა პნევმონიის გართულებით გარდაიცვალა.
ამის დაწერა საჭიროა, რადგან საპირისპირო მსჯელობა ხშირია. „გამომგონებელი HIV–AIDS-ს უარყოფდა“ პანდემიაში ტესტის დასაკნინებლად გამოიყენეს. ორივე მიმართულება მცდარია: ნობელი ყველაფერში მართალს არ ხდის; სხვისი შეცდომა მისი მეთოდის არავალიდურობას არ ნიშნავს. PCR დამოუკიდებლად მოქმედებს: ორმოცი წელი მილიონობით ცდაში განმეორებადია. მეთოდი გამომგონებლის ავტორიტეტით კი არა, განმეორებადობით დგას. ეს კიბოს პაციენტების „ცნობილმა მეცნიერმა თქვა“ მტკიცებების ფილტრიცაა.
ერთი მეთოდი არაა: ოთხი თაობა
1980-იანების და დღევანდელი ონკოლოგიის PCR განსხვავდება. ოთხი თაობა წინა უპასუხო კითხვების საპასუხოდ განვითარდა.
| თაობა | წელი | კითხვა | გაზომვა |
|---|---|---|---|
| კლასიკური (საბოლოო წერტილის) PCR | 1983–85 | „არის ეს თანმიმდევრობა?“ | ბოლოს გელის ზოლს ნახულობენ — თვისებრივი |
| RT-PCR (უკუტრანსკრიფცია) |
1980-იანების ბოლო | „ეს RNA არის? რამდენად გამოიხატება გენი?“ | RNA ჯერ cDNA-დ გარდაიქმნება, შემდეგ მრავლდება |
| რეალურ დროში PCR (qPCR) | 1992 | „რამდენია?“ | ყოველ ციკლში ფლუორესცენცია — ფარდობითი რაოდენობრივი |
| ციფრული PCR (dPCR/ddPCR) | 1999 (ცნება) | „რამდენი მოლეკულაა? 100.000 ნორმალურში 1 მუტანტს პოულობ?“ | ათასობით წვეთში დაყოფა და დადებითების დათვლა — აბსოლუტური რაოდენობრივი |
რეალურ დროში PCR და Ct
კლასიკურში ბოლოში მასალა ილეოდა და პლატო დგებოდა. საწყისი 10 ან 10.000 ასლი მსგავს ზოლს იძლეოდა. ანუ „არის?“ პასუხი შეიძლებოდა, მაგრამ „რამდენია?“ — არა.
1992 Higuchi-ს ნაშრომმა შეცვალა: არა ბოლოს, არამედ მიმდინარეობისას დაკვირვება. ფლუორესცენტური სისტემა შუქს ყოველ ციკლში ზომავს. გავრცელებულ TaqMan ქიმიაში სამიზნე პრობს ერთ ბოლოზე მანათობელი, მეორეზე ჩამქრობი აქვს. დაგრძელებისას Taq შლის, ბოლოები იყოფა და სინათლე გამოდის. მატება გამრავლების პროპორციულია.
რა არის Ct (ან Cq)? ფლუორესცენციის ზღვრის გადალახვის ციკლის ნომერია (ზღვრული/რაოდენობრივი ციკლი; MIQE „Cq“-ს ირჩევს). ლოგიკა უკუღმაა: რაც დაბალია Ct, მით მეტია საწყისი სამიზნე. ბევრი ასლით რეაქცია ზღვარს ადრე აღწევს. „Ct 32 მაქვს, ცოტა ვირუსია?“ აქედან მოდიოდა, თუმცა ხშირად ავიწყდებოდათ, რომ Ct მოწყობილობითა და პროტოკოლით ცვლადი ფარდობითი რიცხვია .
ციფრული PCR: დათვლით გაზომვა
qPCR რეფერენსთან „ამდენჯერ მეტია“ ზომავს. ციფრული ნიმუშს ათასობით მცირე წვეთად ყოფს, თითოეულში ერთი სამიზნეა ან არცერთი. ბოლოს დადებითებს ითვლის. Poisson-ის სტატისტიკით საწყისი მოლეკულა პირდაპირ ითვლება — სტანდარტული მრუდის გარეშე.
ცნებას 1999 წელს Bert Vogelstein-მა და Kenneth Kinzler-მა სახელი მისცეს; პირველი მაგალითი სწორედ იშვიათი კიბოს მუტაციების აღმოჩენა იყო. Cetus-მა 1988-ში განზავებით ერთი β-გლობინი აჩვენა, Morley-მ და Sykes-მა 1992-ში ზღვრული განზავება რაოდენობრივად აქციეს.
ონკოლოგიური მნიშვნელობა იშვიათის პოვნაა. აღწერილი შედეგით მუტანტი, 200.000-ჯერ მეტ ნორმალურ DNA-ში აღმოჩნდება; qPCR-ზე დაახლოებით 2.000-ჯერ მგრძნობიარეა; 1.250.000 უჯრედში ერთის ასეთი იშვიათი თანმიმდევრობების აღმოჩენა შესაძლებელია. სისხლში მოცირკულირე სიმსივნური DNA-ის (ctDNA) წილი მთლიან თავისუფალ DNA-ში ხშირად მეათასედზე ნაკლებია, ამიტომ მგრძნობელობის ეს დონე ფუფუნება კი არა, წინაპირობაა. პირველმა კლინიკურმა წვეთოვანმა სისტემამ 2017-ში CE, 2019-ში ქრონიკული მიელოიდური ლეიკემიისთვის FDA დამტკიცება მიიღო.
RT-PCR და პანდემია
RNA პირდაპირ არ მრავლდება; უკუტრანსკრიპტაზით ჯერ DNA (cDNA) ხდება. დამატებულ მეთოდს RT-PCR ჰქვია. SARS-CoV-2 RNA ვირუსია, ამიტომ ჯერ უკუტრანსკრიფცია და შემდეგ რეალური დრო — RT-qPCR. დახურულ ერთ მუშაობაში აღმოჩენა და რაოდენობა რეფერენს-ტესტად აქცევს.
პანდემიის მთავარი გაკვეთილი ძალაზე კი არა, ზღვარზეა. PCR თანმიმდევრობას პოულობს — ცოცხალ და გადამდებ ორგანიზმს ეკუთვნის თუ არა, ვერ ამბობს. შემდგომი კვირების RNA ფრაგმენტიც დადებითს იძლეოდა. იგივე ონკოლოგიაშიცაა: მუტაციის არსებობას აჩვენებს, მაგრამ მისი მატარებელი უჯრედის მიერ სიმსივნის ზრდას — არა. სწორი გამოყენებისთვის საჭიროა, რას ამბობს და რას არ ამბობს ვიცოდეთ. გლობალური პანდემიური ტესტების სანდო საერთო რაოდენობა ვერ დადასტურდა, ამიტომ რიცხვი არ არის.
ონკოლოგიაში ოთხი მაგალითი
PCR-ის ადგილი კიბოს მედიცინაში ბევრად სცილდება ფორმულირებას „კვლევებში გამოიყენება“. ქვემოთ მოყვანილი ოთხი მაგალითი PCR-ის შედეგის უშუალო მკურნალობის გადაწყვეტილებად ქცევას აჩვენებს.
1. ძუძუს ქიმიოთერაპიის გადაწყვეტილება: Oncotype DX
ჰორმონდადებით, HER2-უარყოფით ადრეულ კიბოში რთულია ოპერაციის შემდეგ ქიმიოთერაპიის საჭიროება. Oncotype DX Breast Recurrence Score ქსოვილის ექსპრესიით პასუხობს. მწარმოებლით, 21 გენის ექსპრესიას აფასებს — 16 კიბოს გენი და 5 რეფერენსი — და იყენებს „სიმსივნის RNA-ის საანალიზო უკუტრანსკრიფციის PCR-ს (RT-PCR)“ . ნიმუში მსხვილნემსიანი ბიოფსიის ან ოპერაციის ქსოვილია.
| კვლევა | პაციენტი | პოპულაცია | შედეგი |
|---|---|---|---|
| TAILORx | 10.273 | კვანძუარყოფითი, 11–25 ქულით რანდომიზებული | 9 წელზე ინვაზიური დაავადებისგან თავისუფალი გადარჩენა %83,3 (მხოლოდ ენდოკრინული) — %84,3 (ენდოკრინული + ქიმიოთერაპია); საერთო გადარჩენა %93,9 – %93,8. ანუ ქიმიოთერაპიის სარგებელი არაა. გამონაკლისი: 50 წლამდე და მათ შორის, 16–25 ქულაში მცირე სარგებელი იყო. |
| RxPONDER | 5.083 | 1–3 დადებითი კვანძი, ქულა ≤25 | 5 წელზე ინვაზიური დაავადებისგან თავისუფალი გადარჩენა — მენოპაუზის შემდეგ: %91,9 შედარებით %91,3-თან (სხვაობა არაა); მენოპაუზამდე: %89,0 შედარებით %93,9-თან (ქიმიოთერაპიის სასარგებლოდ). |
წყაროები: NCI-ის TAILORx და SWOG-ის RxPONDER განცხადებები.
მთავარია არა ვის მისცა ტესტმა ქიმიოთერაპია, არამედ ვის არ მისცა. TAILORx-მა კვანძუარყოფითი საშუალო ქულის ათიათასობით ქალი ქიმიოთერაპიისა და მუდმივი ეფექტებისგან დაიცვა — RT-PCR-ით. RxPONDER-მა მენოპაუზით შედეგის შებრუნება აჩვენა: ერთი რიცხვი ყველასთან იგივე არაა. დეტალები ძუძუს ოპერაციის შემდეგ ქიმიოთერაპიის არმიმღებ პაციენტთა სტატიაში, გენომური ტესტების შედარება კი ლობულური კიბოს გენომური რეციდივის ქულის ტესტების სტატიაშია.
2. ქრონიკული მიელოიდური ლეიკემიის პასუხი: BCR-ABL1
ქრონიკული მიელოიდური ლეიკემია ონკოლოგიაში ის დაავადებაა, სადაც PCR ყველაზე ღრმადაა დამკვიდრებული. დაავადების მამოძრავებელი BCR-ABL1 ფუზიური ტრანსკრიპტი რაოდენობრივი RT-PCR-ით იზომება და საერთაშორისო სკალით (International Scale, IS) ანგარიშდება. წარმატება შემცირება კი არა, რიცხვის რამდენი ლოგარითმით კლებაა .
| დონე | განსაზღვრება | მნიშვნელობა |
|---|---|---|
| %1 IS | BCR-ABL1 ≤ %1 | სრული ციტოგენეტიკური პასუხის ეკვივალენტი |
| MMR / MR3 | BCR-ABL1 ≤ %0,1 | საწყისთან შედარებით 3 log კლებული — მთავარი მოლეკულური პასუხი |
| MR4 | ≤ %0,01 ან >10.000 ABL1 ტრანსკრიპტით გამოუვლენელი | 4 log კლება |
| MR4.5 | ≤ %0,0032 ან >32.000 ABL1 ტრანსკრიპტით გამოუვლენელი | 4,5 log კლება |
| MR5 | ≤ %0,001, >100.000 ABL1 ტრანსკრიპტით | 5 log კლება |
საკვანძო პასუხები ჩვეულებრივ 3., 6. და 12. თვეში ფასდება. ტრანსკრიპტი მგრძნობელობის პირობაა: MR4.5-ისთვის მინიმუმ 32.000 კონტროლი უნდა გამრავლდეს.
ცხრილი PCR-ის სიზუსტის თვალსაჩინო მაგალითია. ათი ათასში სამის გაზომვა მილიონში რამდენიმე მოლეკულის დათვლაა — ყოველ სამ თვეში რუტინულ ლაბორატორიაში. ღრმა მდგრადი პასუხი ზოგში TKI-ის შეწყვეტის ცდის (უმკურნალო რემისია) განხილვას იძლევა. საჭირო სიღრმე და დრო აქ ვერ დადასტურდა; გადაწყვეტილება ჰემატოლოგისაა და რიცხვითი ზღვარი არაა.
3. HPV ყელის კიბოს სკრინინგში
ბოლო ოც წელში უჯრედის (ციტოლოგია/ნაცხი) ნაცვლად ვირუსის ნუკლეინის მჟავაზე გადავიდა. ACS-ის 2020 გაიდლაინი ამბობს: „25-დან 65 წლამდე ხუთ წელიწადში ერთხელ პირველადი HPV (Pap-ის გარეშე) სასურველი მეთოდია“ ; ერთობლივი და მხოლოდ ციტოლოგია მისაღები ალტერნატივებია, რადგან დამტკიცებული HPV ყველგან არაა.
გასარჩევია: ყველა HPV ტესტი PCR არ არის. Aptima DNA-ს ნაცვლად E6/E7 mRNA-ს ადგენს და სხვა გამრავლებას იყენებს. ეს მხოლოდ ვირუსის არსებობას კი არა, ონკოგენების აქტივობას აჩვენებს, როგორც ამტკიცებს.
სიახლე: თვითაღება. FDA-მ, 14 მაისს 2024 წელს ორი ტესტისთვის — BD Onclarity HPV და Roche cobas HPV — თვითაღება დაამტკიცა, ნიმუში „პირველადი კაბინეტის, გადაუდებელი ცენტრის, აფთიაქის ან მობილური კლინიკის მსგავს სამედიცინო გარემოში“ უნდა აიღონ. გინეკოლოგიური შიშით სკრინინგის არმიმღებისთვის მნიშვნელოვანია. პრევენცია ყელის კიბოს სტატიაში ავხსენით.
4. გლიობლასტომის პასუხის პროგნოზი: MGMT მეთილირება
MGMT პრომოტერის მეთილირება თემოზოლომიდის სარგებელს პროგნოზირებს. მთავარი მეთოდია მეთილირებასპეციფიკური PCR (MSP), მეორე — პიროსეკვენირება (PSQ).
Neuro-Oncology -ის Cochrane-ზე დაფუძნებულ მეტაანალიზში დაახლოებით 190 ერთმეთოდიანი კვლევაა (27.710 მონაწილე); 94 MSP, 27 პიროსეკვენირება გამოიყენა. თემოზოლომიდში პროგნოზი იმუნოჰისტოქიმიასთან შედარებით: MSP რისკების თანაფარდობათა თანაფარდობა (RHR) 1,31 (%95 CI 1,01–1,71), პიროსეკვენირების 1,36 (1,01–1,84) იყო; მათ შორის მნიშვნელოვანი სხვაობა არაა (1,14; 0,87–1,48). CpG 74–78 უბნებისთვის %9ზღვარი %28–29-ზე უკეთ მუშაობდა.
ეს ნაკლებად განხილულ მხარეს აჩვენებს: იმავე მეთოდითა და ნიმუშით განსხვავებული ზღვრით ორი ლაბორატორია განსხვავებულ პასუხს იძლევა. „MGMT მეთილირებულია“ მეთოდისა და ზღვრის გარეშე არასრულია. მკურნალობის განსაზღვრა გლიობლასტომის მოლეკულური დიაგნოზისა და IDH ველური ტიპის მაღალი ხარისხის გლიომის სტატიებშია.
PCR-ზე დაფუძნებული თანმხლები დიაგნოსტიკა
FDA-ის სიაში ბევრი PCR კონკრეტული წამლის ეტიკეტშია და მიმღებს არჩევს. ქვემოთ პირდაპირ სიიდანაა.
| ტესტი | მწარმოებელი | PMA № | შესაბამისი წამლები |
|---|---|---|---|
| cobas EGFR Mutation Test v2 | Roche Molecular Systems | P120019 | ოსიმერტინიბი, ერლოტინიბი, გეფიტინიბი, აფატინიბი |
| therascreen KRAS RGQ PCR Kit | QIAGEN | P140022 | ცეტუქსიმაბი, პანიტუმუმაბი |
| cobas KRAS Mutation Test | Roche Molecular Systems | P140023 | ცეტუქსიმაბი, პანიტუმუმაბი |
| therascreen PIK3CA RGQ PCR Kit | QIAGEN | P180001 | ალპელისიბი |
| cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test | Roche Molecular Systems | P110020 | ვემურაფენიბი; შემდეგ კობიმეტინიბი |
| therascreen BRAF | QIAGEN | P130010 | ვემურაფენიბი |
მწარმოებელი, PMA და წამლები FDA-ის თანმხლები დიაგნოსტიკის სიიდანაა. წლები სათითაოდ ვერ დადასტურდა და ცხრილში არაა — თითოეული ტესტის თარიღი accessdata.fda.gov-ზე PMA ნომრით შეიძლება შემოწმდეს.
ეს ცხრილი ერთი შეხედვით აჯამებს PCR-ის როლს ონკოლოგიაში: ფილტვის კიბოს დროს რომელი პაციენტი მიიღებს EGFR ინჰიბიტორს, კოლორექტალური კიბოს დროს რომელ პაციენტს არ მიეცემა anti-EGFR ანტისხეული, მელანომის დროს რომელი პაციენტია შესაფერისი BRAF ინჰიბიტორისთვის — ყველაფერი PCR-ის შედეგზეა დამოკიდებული. კარცინომის ტიპის განმსაზღვრელი პათოლოგიის დასკვნა უკვე მარტო საკმარისი არაა; მას მოლეკულური დასკვნაც ემატება.
თხევადი ბიოფსია და მინიმალური ნარჩენი დაავადება: სრულდება PCR-ის ეპოქა?
სისხლში მოცირკულირე სიმსივნური DNA-ის (ctDNA) გაზომვით იმის გარკვევა, დარჩა თუ არა ოპერაციის შემდეგ მიკროსკოპული დაავადება — ანუ მინიმალური ნარჩენი დაავადების (MRD) მონიტორინგი — ონკოლოგიის ერთ-ერთი ყველაზე სწრაფად მზარდი სფეროა. ციფრული PCR-ის იშვიათი ვარიანტებისადმი მგრძნობელობის გათვალისწინებით, მოსალოდნელი იყო, რომ ეს PCR-ის ბუნებრივი დომინირების სფერო იქნებოდა. რეალობა უფრო რთულია.
საჭიროა გავრცელებული შეცდომის გასწორება. სიმსივნის მონაცემებზე მორგებული, ხშირად გამოყენებული MRD ტესტებიდან Signatera-ს ხშირად „პერსონალიზებულ მულტიპლექსურ PCR-ად“ აღწერენ. მწარმოებლის მიმდინარე გვერდი ექიმებისთვის ტესტს ასე განმარტავს: სიმსივნური ქსოვილის მთლიანი ეგზომის ან მთლიანი გენომის სეკვენირებით იქმნება ინდივიდზე მორგებული პანელი, ირჩევა64 კლონური ვარიანტი და მათ სისხლში „თითოეული შერჩეული ვარიანტისთვის350.000-ჯერ სიღრმის ულტრაღრმა სეკვენირებით“ ეძებენ. ანუ წაკითხვის ეტაპი სეკვენირებაა და არა PCR. იგივე გვერდი ნათლად აღნიშნავს, რომ ტესტი FDA-ის მიერ დამტკიცებული არაა („აშშ-ის სურსათისა და წამლის ადმინისტრაციას არ გაუცია ნებართვა ან დამტკიცება“); ლაბორატორია CLIA-ისა და CAP-ის აკრედიტაციით მუშაობს და ტესტი Medicare-ით იფარება დაავადების პროგრესირების, რეციდივისა და რელაფსის მონიტორინგისთვის.
აქედან გამომდინარე დასკვნა PCR-ის უკუსვლა კი არა, შრომის განაწილების შეცვლაა. როდესაც სიმსივნეში რომელი მუტაციებია არ იცით, სეკვენირებაა საჭირო — რადგან PCR მხოლოდ იმას პოულობს, რასაც ეძებთ. მაგრამ როდესაც იცით, რომელ მუტაციას ეძებთ, და ეს ცნობილია, PCR უფრო სწრაფი, უფრო იაფი და ხშირად საკმარისად მგრძნობიარეა. ctDNA-ით მკურნალობის ცვლილების კლინიკური მნიშვნელობა GALAXY კვლევის და SERENA-6-ში ESR1 მუტაციის მიხედვით მკურნალობის შეცვლის ჩვენს სტატიებში განვიხილეთ; სისხლის ტესტით სკრინინგის საკითხი კი ფრაგმენტომიკასა და მეთილაციაზე დაფუძნებული მსხვილი ნაწლავის კიბოს სკრინინგის სტატიაში განვიხილეთ.
PCR თუ ახალი თაობის სეკვენირება?
ამ კითხვას ხშირად სვამენ და, ჩვეულებრივ, არასწორად აყალიბებენ. ეს ორი კონკურენტი კი არა, სხვადასხვა კითხვაზე პასუხის გასაცემი ინსტრუმენტია. კიბოს ეროვნული ინსტიტუტის განმარტებით, ბიომარკერების ტესტების ნაწილი „ერთ ბიომარკერს ამოწმებს“, ნაწილი კი „ერთდროულად მრავალ ბიომარკერს ამოწმებს და შეიძლება მრავალგენიან ან პანელურ ტესტებად იწოდებოდეს“; ზოგი მთელი ეგზომის ან მთელი გენომის წაკითხვას ახდენს.
| PCR-ზე დაფუძნებული ტესტი | ახალი თაობის სეკვენირება (NGS) | |
|---|---|---|
| ძირითადი ლოგიკა | პოულობს იმას, რასაც ეძებს | კითხულობს იმას, რაც არსებობს |
| სამიზნე | წინასწარ განსაზღვრული, შეზღუდული რაოდენობის ვარიანტები | ფართო პანელი, ეგზომი ან გენომი |
| უცნობი ვარიანტი | ვერ ხედავს — პრაიმერი არ არის შექმნილი | შეუძლია დანახვა |
| რეგულაციური სტატუსი | შეიძლება იყოს პრეპარატის ინსტრუქციაში დასახელებული თანმხლები დიაგნოსტიკური ტესტი | არსებობს ფართო პანელების დამტკიცებებიც |
| ტიპური გამოყენება | ერთი კონკრეტული გადაწყვეტილების მიღება | რუკის შედგენა |
შენიშვნა: ამ ცხრილში განზრახ არ არის მოცემული დროის, ღირებულებისა და მგრძნობელობის შედარება. ამ საკითხებზე გავრცელებული რიცხვებისთვის სტატიის მომზადებისას ავტორიტეტული წყარო ვერ დადასტურდა; ვარაუდების ნაცვლად ეს მონაცემები ცარიელი დარჩა.
სტრუქტურული არგუმენტი ასეთია: FDA დღესაც აგრძელებს ერთ ვარიანტზე ორიენტირებული PCR ტესტების თანმხლებ დიაგნოსტიკურ ტესტებად დამტკიცებას და მათი სახელები პრეპარატების ინსტრუქციებშია. სეკვენირებას PCR სრულად რომ ჩაენაცვლებინა, ამ სიაში PCR-ის სტრიქონები გაქრებოდა. ისინი არ ქრება. მუტაციების რუკისთვის სეკვენირება, ცნობილ მუტაციაზე დაყრდნობით გადაწყვეტილებისთვის PCR — ორივე ერთად მუშაობს. მუტაციის გენში მდებარეობის მნიშვნელობის მაჩვენებელი კვლევებიც სწორედ ამ ორდონიანი მიდგომის პროდუქტია.
PCR-ის შეზღუდვები და შეცდომების წყაროები
ვერცერთი მეთოდი ვერ გამოიყენება სწორად მისი შეზღუდვების ცოდნის გარეშე. კლინიკაში PCR-ის ყველაზე ხშირი პრობლემები შემდეგია:
PCR-ის ძალა მისი სისუსტეცაა: ვინაიდან ერთი მოლეკულის გამრავლებაც შესაძლებელია, წინა რეაქციიდან ჰაერში მოხვედრილმა პროდუქტმა შეიძლება ცრუ დადებითი შედეგი გამოიწვიოს. ამიტომ მოლეკულურ ლაბორატორიებში ცალკე ოთახები და ცალმხრივი სამუშაო ნაკადი აუცილებელია.
სისხლში ჰემოგლობინმა, ქსოვილში ფორმალინის ნარჩენმა ან ჰეპარინმა შეიძლება ფერმენტი დათრგუნოს. შედეგი ცრუ უარყოფითია — და შიდა კონტროლის გარეშე ეს შეუმჩნეველი რჩება.
PCR მხოლოდ იმ თანმიმდევრობას ხედავს, რომლისთვისაც პრაიმერი შექმენით. პანელში არმყოფი მუტაცია აღირიცხება როგორც „მუტაცია არ არის“. ეს ნიშნავს, რომ უარყოფითი შედეგი ყოველთვის ყურადღებით უნდა იკითხებოდეს.
კორექციის აქტივობის არმქონე Taq დაახლოებით ყოველ9.000 ნუკლეოტიდში ერთ შეცდომას უშვებს. დიაგნოსტიკურ ტესტებში ეს უმნიშვნელოა, სეკვენირებამდე გამრავლებისას კი მნიშვნელოვანია.
პარაფინში ჩასმულ ქსოვილებში DNA ფრაგმენტირებულია. გრძელი სამიზნეები არ მრავლდება. ტესტის წარუმატებლობა ხშირად მეთოდის კი არა, ნიმუშის პრობლემაა.
PCR პოულობს თანმიმდევრობას, მაგრამ არ აჩვენებს, ცოცხალია თუ არა მისი მატარებელი ორგანიზმი ან აქტიურია თუ არა უჯრედი. ინტერპრეტაცია ყოველთვის კლინიკურ კონტექსტთან ერთად ხდება.
PCR-ის გამოყენების სფეროები
| სფერო | გამოყენება |
|---|---|
| ონკოლოგია | თანმხლები დიაგნოსტიკური ტესტები (EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA) |
| გენების ექსპრესიაზე დაფუძნებული რეციდივის ქულები (21 გენის RT-PCR ტესტი) | |
| მოლეკულური პასუხის მონიტორინგი ჰემატოლოგიურ ავთვისებიან დაავადებებში (BCR-ABL1) | |
| მეთილაციის სტატუსის განსაზღვრა (MGMT) | |
| გენეტიკა | მემკვიდრეობითი დაავადებების მატარებლობისა და დიაგნოზის დადგენა |
| დაბადებამდე (პრენატალური) დიაგნოსტიკა | |
| ინ ვიტრო განაყოფიერებისას პრეიმპლანტაციური გენეტიკური ტესტირება | |
| ინფექცია | ვირუსული და ბაქტერიული პათოგენების გამოვლენა |
| ვირუსული დატვირთვის გაზომვა (HIV, HBV, HCV) | |
| HPV-ზე დაფუძნებული საშვილოსნოს ყელის კიბოს სკრინინგი | |
| სასამართლო მედიცინა | პიროვნების იდენტიფიკაცია და მამობის ტესტი |
| DNA პროფილის მიღება ძალიან მცირე რაოდენობის ნიმუშიდან | |
| კვლევა | კლონირება, გამრავლება სეკვენირებამდე |
| DNA–ცილის ურთიერთქმედებების შესწავლა | |
| ევოლუციური ბიოლოგია და უძველესი DNA-ის კვლევები | |
| სურსათი და მრეწველობა | სახეობის განსაზღვრა და ფალსიფიკაციის კონტროლი |
| ალერგენებისა და გენმოდიფიცირებული ორგანიზმების გამოვლენა |
ვითარება თურქეთში
HPV ტესტი ეროვნულ სკრინინგის პროგრამაში
თურქეთის საშვილოსნოს ყელის კიბოს სკრინინგის პროგრამის ეროვნული სტანდარტების დოკუმენტში სკრინინგი ასე განისაზღვრება: „ქალებში30 წლის ასაკში დაწყებული და65 წლის ასაკში დასრულებული პოპულაციაზე დაფუძნებული სკრინინგია“ და „იდეალური მეთოდია ყოველ ხუთ წელიწადში HPV ტესტით ან Pap-smear ტესტით სკრინინგი“. ტესტი „HPV ან Pap-smear ტესტი ყოველ ხუთ წელიწადში მეორდება“ ფორმულირებით ხუთწლიან ინტერვალს უკავშირდება.
ნიმუშის აღებას ახორციელებს „ASM-ში ან TSM-ში (KETEM) მომუშავე, ამ საკითხში მომზადებული სამედიცინო პერსონალი“ ; აღებული ნიმუშები „თურქეთის საზოგადოებრივი ჯანმრთელობის დაწესებულების ან საზოგადოებრივი ჯანმრთელობის სამმართველოების მიერ განსაზღვრულ ცენტრებში, შესაფერის ფიქსაციის პირობებში, გამოკვლევისთვის“ იგზავნება. ანუ პროგრამა ცენტრალიზებულ ლაბორატორიულ სტრუქტურაზეა აგებული — ეს HPV ტესტის პოპულაციაში გამოყენების ტექნიკური წინაპირობაა.
ამ დოკუმენტის მიმდინარე ვერსია, პროგრამის დღევანდელი მუშაობა, გამოყენებული ტესტების ბრენდები და მოცვის მაჩვენებლები ამ სტატიისთვის ვერ დადასტურდა. ჩვენ ხელთ არსებული ტექსტი პროგრამის სტანდარტების განმსაზღვრელი ოფიციალური დოკუმენტია; მიმდინარე პრაქტიკის დეტალებისთვის ჯანდაცვის სამინისტროს საკუთარ წყაროებს უნდა მიმართოთ. ქვეყანაში კიბოს ტვირთის საერთო სურათისთვის თურქეთის კიბოს სტატისტიკის ჩვენი სტატია შეგიძლიათ იხილოთ.
მოლეკულური პათოლოგია და ხარჯების ანაზღაურება
ამ სტატიაში SGK-ის მიერ ხარჯების ანაზღაურების შესახებ არანაირი მტკიცება არ კეთდება. იფარება თუ არა თურქეთში Oncotype DX-ის მსგავსი გენების ექსპრესიაზე დაფუძნებული რეციდივის ქულის ტესტები, PCR-ზე დაფუძნებული თანმხლები დიაგნოსტიკური ტესტები ან ctDNA/MRD ტესტები, ამ სტატიისთვის ვერ დადასტურდა. ამ საკითხზე გავრცელებულ კატეგორიულ განცხადებებს სიფრთხილით უნდა მოვეკიდოთ; მიმდინარე ვითარება მკურნალ ექიმსა და შესაბამის დაწესებულებასთან უნდა დაზუსტდეს. ახალ წამლებსა და ტესტებზე ხელმისაწვდომობის საერთო სურათი FDA-ის მიერ დამტკიცებული ახალი კიბოს წამლების თურქეთში ხელმისაწვდომობის რუკის სტატიაში განვიხილეთ.
პრაქტიკული შენიშვნა: EGFR, KRAS, BRAF-ის მსგავსი მუტაციების ტესტები თურქეთში უნივერსიტეტის, სასწავლო-კვლევით საავადმყოფოებსა და კერძო მოლეკულური პათოლოგიის ლაბორატორიებში ფართოდ ტარდება. პაციენტისთვის ტესტის ჩატარება-არჩატარების გარდა მნიშვნელოვანია, რა მეთოდით და რა მოცულობით ტარდება იგი: „KRAS მუტაცია არ გამოვლინდა“ დასკვნის სრულფასოვანი ინტერპრეტაცია შეუძლებელია იმის ცოდნის გარეშე, თუ რომელი კოდონებია პანელში.
ქრონოლოგია
DROZDOGAN აკადემიის კომენტარი
PCR-ის ისტორია ერთ-ერთი ყველაზე ნათელი მაგალითია იმისა, როგორ ვრცელდება მედიცინაში კარგი იდეა. თუმცა ამ სტატიის განახლებისას განსაკუთრებით ყურადღება მიიპყრო იმან, რომ თავად მეთოდთან ერთად მის შესახებ მონათხრობსაც გადამოწმება სჭირდება .
⚡ რატომ არის მნიშვნელოვანი
რადგან PCR ონკოლოგიაში უკვე ფონური ტექნოლოგია კი არა, გადაწყვეტილების მიღების წერტილია.21 გენის RT-PCR-ის შედეგი ათასობით ქალს ქიმიოთერაპიის არმიღების საშუალებას აძლევს. BCR-ABL1-ის გაზომვა ადგენს, განაგრძობს თუ არა პაციენტი მკურნალობას. EGFR ტესტი წყვეტს, რომელი წამალი მიეცეს. პაციენტისთვის ეს ნიშნავს: ფრაზა „ტესტის პასუხი ჯერ არ არის“ იგივეა, რაც „მკურნალობას ვერ ვიწყებთ“. PCR-ის ცოდნა საკუთარი მკურნალობის პროცესის გაგების ნაწილია.
✅ ძლიერი მხარე
PCR-ის ორმოცი წლის განმავლობაში შენარჩუნების მიზეზი მისი ელეგანტურობა კი არა, განმეორებადობაა. იგივე ნიმუში, იგივე პრაიმერები, იგივე პროტოკოლი — მსოფლიოს ნებისმიერ ადგილას იგივე შედეგი. ქრონიკული მიელოიდური ლეიკემიის დროს ათი ათასში სამის შეფარდების საერთაშორისო სკალაზე დაფუძნებული ანგარიშგება ამ სტანდარტიზაციის კონკრეტული დასტურია: ანკარისა და ბოსტონის ლაბორატორიების მაჩვენებლები შედარებადია. ონკოლოგიაში ასე კარგად სტანდარტიზებული გაზომვა ცოტაა.
⚠️ სუსტი მხარე
PCR მხოლოდ იმას, რასაც ეძებთ, პოულობს. უარყოფითი შედეგების ყველაზე შეცდომაში შემყვანი მხარე ესაა: „მუტაცია არ გამოვლინდა“ დასკვნა ხშირად ნიშნავს „ჩვენს პანელში არსებული მუტაციები არ გამოვლინდა“ და ეს ორი ერთი და იგივე არაა. როგორც MGMT-ის მაგალითში ვნახეთ, ერთი მეთოდით მომუშავე ორ ლაბორატორიას განსხვავებული ზღურბლის გამოყენებით ერთი პაციენტისთვის განსხვავებული შედეგის მიცემა შეუძლია. არის კონტამინაციის პრობლემაც: მეთოდი, რომელსაც ერთი მოლეკულის გამრავლება შეუძლია, ჰაერში მოხვედრილ ერთ მოლეკულასაც გაამრავლებს. PCR-ის მგრძნობელობა ამავე დროს მისი მოწყვლადობაცაა.
🩺 რა ვუთხრათ პაციენტს
(1) მოლეკულური ტესტის დანიშვნისას აუხსენით, რომ პასუხს რამდენიმე დღიდან რამდენიმე კვირამდე შეიძლება დასჭირდეს და ეს ლოდინი, ჩვეულებრივ, სწორი მკურნალობის შესარჩევად აუცილებელია. (2) დასკვნა ერთად წაიკითხეთ: აჩვენეთ, რომელი გენები და რომელი მეთოდით შემოწმდა. (3) უთხარით, რომ „უარყოფითი“ შედეგი აბსოლუტური არაა და პანელის მოცულობაზეა დამოკიდებული. (4) თავიდანვე აღნიშნეთ, რომ ქსოვილის არასაკმარისობისას შეიძლება ტესტის განმეორება ან სისხლის ნიმუშით მუშაობა გახდეს საჭირო — ეს შემდგომი შეფერხებების ყველაზე ხშირი მიზეზია. (5) შეახსენეთ, რომ ინტერნეტში შეხვდებიან მტკიცებებს „PCR ტესტები არასანდოა“ და მათი წყარო უმეტესად თავად მეთოდს არ უკავშირდება.
❓ ღია კითხვები
სიმსივნის მონაცემებზე მორგებული MRD ტესტები სეკვენირებაზე გადავიდა; შეუძლია ციფრულ PCR-ს ამ სფეროში უფრო იაფ და სწრაფ ალტერნატივად დაბრუნება? მეორე: ctDNA-დადებით პაციენტში, რომლის ვიზუალიზაციაზეც არაფერი ჩანს, მკურნალობის ადრე დაწყება ნამდვილად ახანგრძლივებს სიცოცხლეს თუ მხოლოდ რეციდივის შესახებ ვიგებთ უფრო ადრე? ეს MRD-ის სფეროს ძირითადი უპასუხო კითხვაა. მესამე: რატომ იცვლება გენების ექსპრესიაზე დაფუძნებული რეციდივის ქულების მნიშვნელობა მენოპაუზის სტატუსის მიხედვით — თავად ქიმიოთერაპია მოქმედებს თუ მის მიერ გამოწვეული მენოპაუზა?
დასკვნა: PCR ორმოცი წლის შემდეგაც ინარჩუნებს ადგილს — თუმცა უკვე არა მარტო, არამედ სეკვენირებასთან შრომის განაწილებით. ონკოლოგიაში გამოყენების გაფართოებასთან ერთად, თავად მეთოდზე მეტად მისი დასკვნის წაკითხვის წესი სულ უფრო მნიშვნელოვანია. ამ სტატიის განახლებისას ყველაზე შრომატევადი ნაწილი ახალი ინფორმაციის დამატება კი არა, ძველი ინფორმაციის მცდარი ნაწილის გაფილტვრა აღმოჩნდა: რვა გავრცელებული ფორმულირებიდან რვავეს შესწორება დასჭირდა. მიაჩნიათ, რომ ცოდნა არ ძველდება; სინამდვილეში ყველაზე ხშირად გამეორებული ინფორმაცია ყველაზე სწრაფად ძველდება.
ხშირად დასმული კითხვები
- რამდენ ხანში მიიღება PCR ტესტის პასუხი?
- თავად რეაქცია ჩვეულებრივ1–3 საათს გრძელდება. თუმცა კლინიკური პასუხისთვის საჭირო საერთო დრო ბევრად მეტია: ნიმუშის აღება, ლაბორატორიაში მიტანა, DNA/RNA-ის გამოყოფა, რეაქცია, ინტერპრეტაცია და ანგარიშგება. ონკოლოგიაში ქსოვილზე დაფუძნებული მოლეკულური ტესტების პასუხი, ჩვეულებრივ, დღეების ან კვირების განმავლობაში მზადდება. ეს დრო მეთოდის სისწრაფით კი არა, მთელი პროცესითაა განპირობებული.
- რას ნიშნავს „მუტაცია არ გამოვლინდა“?
- ეს ნიშნავს, რომ შემოწმებულ პანელში არსებული მუტაციები არ გამოვლინდა — არ ნიშნავს, რომ არანაირი მუტაცია არ არსებობს. PCR მხოლოდ იმ თანმიმდევრობებს ხედავს, რომელთათვისაც პრაიმერი შეიქმნა. დასკვნაში უნდა ეწეროს, გენის რომელი უბნები შემოწმდა; თუ არ წერია, უნდა იკითხოთ.
- რა განსხვავებაა PCR-სა და ახალი თაობის სეკვენირებას შორის?
- PCR პოულობს იმას, რასაც ეძებს; სეკვენირება კითხულობს იმას, რაც არსებობს. ერთ ცნობილ მუტაციაზე დაყრდნობით გადაწყვეტილებისთვის PCR გამოდგება; სიმსივნის მოლეკულური რუკისთვის — სეკვენირება. ისინი კონკურენტები კი არა, ურთიერთშემავსებლებია — FDA დღესაც ამტკიცებს ერთ ვარიანტზე ორიენტირებულ PCR ტესტებს თანმხლებ დიაგნოსტიკურ ტესტებად.
- დაბალი Ct მნიშვნელობა მძიმე დაავადებას ნიშნავს?
- Ct საწყისი სამიზნის რაოდენობასთან უკუპროპორციულია: დაბალი Ct ბევრ სამიზნეს ნიშნავს. თუმცა Ct შედარებითი რიცხვია და მოწყობილობის, ნაკრებისა და ნიმუშის აღების ტექნიკის მიხედვით იცვლება. სხვადასხვა ლაბორატორიის Ct მნიშვნელობები პირდაპირ ვერ შედარდება და მარტო Ct დაავადების სიმძიმის საზომი არაა.
- კიბოს დიაგნოზი PCR-ით ისმება?
- არა. კიბოს დიაგნოზი პათოლოგიური კვლევით — ქსოვილის მიკროსკოპული შეფასებით ისმება. დიაგნოზის შემდეგ PCR გამოიყენება სიმსივნის მოლეკულური მახასიათებლების დასადგენად, მკურნალობის შესარჩევად და პასუხის მონიტორინგისთვის. გამონაკლისია კიბოსწინარე მდგომარეობების გამოსავლენი სკრინინგი, მაგალითად HPV სკრინინგი — იქაც საბოლოო დიაგნოზი კვლავ პათოლოგიით ისმება.
- სისხლის ტესტით კიბოს გამოვლენა შესაძლებელია?
- შესაძლებელია სისხლში მოცირკულირე სიმსივნური DNA-ის (ctDNA) გამოვლენა და ეს სფერო სწრაფად ვითარდება. თუმცა დღევანდელი გამოყენების მთავარი მიმართულება სკრინინგი კი არა, დიაგნოზირებულ პაციენტში მკურნალობის შერჩევა და რეციდივის მონიტორინგია. სიმსივნის მონაცემებზე მორგებული მონიტორინგის ტესტების მნიშვნელოვანი ნაწილი უკვე სეკვენირებას ეფუძნება და არა PCR-ს; მათგან ზოგი FDA-ის მიერ დამტკიცებული არაა და ლაბორატორიის მიერ შემუშავებულ ტესტად მუშაობს.
- შეიძლება PCR ტესტმა მცდარი შედეგი მოგვცეს?
- დიახ. ცრუ დადებითი შედეგის მთავარი წყარო კონტამინაციაა — PCR-ს ერთი მოლეკულის გამრავლებაც შეუძლია, ამიტომ ჰაერში მოხვედრილი პროდუქტი პრობლემას ქმნის. ცრუ უარყოფითის ძირითადი მიზეზებია ინჰიბირება (სისხლი, ფორმალინი, ჰეპარინი), ნიმუშში DNA-ის ფრაგმენტირება და საძიებო ვარიანტის პანელში არარსებობა. ამიტომ კარგი ტესტი შიდა კონტროლს შეიცავს.
- ვინ გამოიგონა PCR, ერთი ადამიანი იყო?
- იდეა Kary Mullis-ს ეკუთვნის და1993 წლის ნობელის პრემია ქიმიაში სწორედ ამიტომ მიენიჭა. თუმცა მეთოდის ამუშავება, დაავადებაში პირველი გამოყენება და ავტომატიზაცია Cetus Corporation-ის დიდი გუნდის მუშაობის შედეგია —1985 წლის პირველ სტატიას შვიდი ავტორი ჰყავს და პირველი ავტორი Randall Saiki-ა.
- ტარდება თურქეთში HPV სკრინინგი?
- ეროვნული სკრინინგის სტანდარტები30–65 წლის ქალებში ყოველ ხუთ წელიწადში HPV ტესტით ან Pap-smear-ით პოპულაციურ სკრინინგს განსაზღვრავს. ნიმუშს ASM-ში ან KETEM-ში მომზადებული სამედიცინო პერსონალი იღებს და განსაზღვრულ ცენტრებში გზავნის. პროგრამის მიმდინარე მუშაობის დეტალები და მოცვის მაჩვენებლები ამ სტატიისთვის ვერ დადასტურდა.
- ანაზღაურდება ეს ტესტები თურქეთში?
- ამ სტატიაში ანაზღაურებაზე არანაირი მტკიცება არ კეთდება — Oncotype DX-ის მსგავსი გენების ექსპრესიის ტესტების, PCR-ზე დაფუძნებული თანმხლები დიაგნოსტიკური ტესტებისა და ctDNA ტესტების SGK-ით დაფარვის სტატუსი ვერ დადასტურდა. მიმდინარე ინფორმაცია მკურნალ ექიმსა და შესაბამის დაწესებულებასთან უნდა გადამოწმდეს.
ლექსიკონი
- პრაიმერი
- სამიზნე DNA თანმიმდევრობის ორივე ბოლოზე მიმაგრებადი, ჩვეულებრივ18–25 ნუკლეოტიდისგან შემდგარი სინთეზური DNA ფრაგმენტი. განსაზღვრავს გასამრავლებელი უბნის საზღვრებს.
- Tm (დნობის ტემპერატურა)
- ტემპერატურა, რომელზეც პრაიმერი თავისი სამიზნის ნახევარს სცილდება. მიმაგრების ტემპერატურა მასზე3–5 °C-ით დაბლა დგინდება.
- დენატურაცია
- ორჯაჭვიანი DNA-ის სითბოთი ორ ერთმაგ ჯაჭვად დაშლა.
- Taq პოლიმერაზა
- Thermus aquaticus-იდან მიღებული სითბოგამძლე DNA პოლიმერაზა. ოპტიმუმი75–80 °C;3'→5' მაკორექტირებელი აქტივობა არ აქვს.
- თერმოციკლერი
- მოწყობილობა, რომელიც PCR სინჯარის ტემპერატურას დაპროგრამებული თანმიმდევრობით ცვლის.
- RT-PCR
- უკუტრანსკრიფციული PCR. RNA ჯერ cDNA-ად გარდაიქმნება, შემდეგ მრავლდება.
- qPCR / რეალური დროის PCR
- PCR, რომლის დროსაც გამრავლებას თითოეულ ციკლში ფლუორესცენციის გაზომვით აკვირდებიან. იძლევა რაოდენობრივ შედეგს.
- Ct / Cq
- ციკლის ნომერი, რომელზეც ფლუორესცენტული სიგნალი ზღურბლს გადალახავს. დაბალი მნიშვნელობა საწყის ეტაპზე ბევრ სამიზნეს ნიშნავს.
- TaqMan ზონდი
- ზონდი, რომლის ერთ ბოლოზე მანათობელი მოლეკულაა, მეორეზე — ჩამქრობი. პოლიმერაზით დაშლისას სინათლე თავისუფლდება.
- ციფრული PCR (dPCR/ddPCR)
- მეთოდი, რომლის დროსაც ნიმუში ათასობით განყოფილებად იყოფა და დადებითი განყოფილებები ითვლება. სტანდარტული მრუდის გარეშე აბსოლუტურ დათვლას ახდენს.
- თანმხლები დიაგნოსტიკური ტესტი
- დამტკიცებული ტესტი, რომელიც პრეპარატის ინსტრუქციაშია დასახელებული და განსაზღვრავს, ვის უნდა მიეცეს ეს პრეპარატი.
- ctDNA
- სისხლში მოცირკულირე, სიმსივნიდან წარმოშობილი DNA. მთლიან თავისუფალ DNA-ში მისი წილი ხშირად ძალიან მცირეა.
- მინიმალური ნარჩენი დაავადება (MRD)
- მკურნალობის შემდეგ ვიზუალიზაციით გამოუვლენელი, თუმცა მოლეკულური მეთოდებით დასადგენი მიკროსკოპული დაავადება.
- საერთაშორისო სკალა (IS)
- სტანდარტიზებული ანგარიშგების სკალა, რომელიც BCR-ABL1-ის გაზომვების ლაბორატორიებს შორის შედარებისთვის გამოიყენება.
- მეთილაციის სპეციფიკური PCR (MSP)
- PCR ისეთი პრაიმერებით, რომლებიც DNA-ის მეთილირებული და არამეთილირებული ფორმების გასარჩევადაა შექმნილი.
- კონტამინაცია
- ნიმუშში წინა რეაქციებიდან ან გარემოდან DNA-ის მოხვედრა. PCR-ში ცრუ დადებითი შედეგის მთავარი მიზეზია.
გამჭვირვალობის შენიშვნა.
დადასტურებული: 1985 Science სტატიის ავტორთა სრული სია, ტომი და გვერდები; Mullis-ისა და Faloona-ს1987 წლის Methods in Enzymology სტატია;1968 წლის ნობელის პრემიის ფიზიოლოგიასა ან მედიცინაში მიმღებები და დასაბუთება; Khorana-ს1972 წლის გენის სინთეზი; Kornberg-ის1956 წლის აღმოჩენა და1959 წლის ნობელი; Thermus aquaticus-ის1969 წელს Brock-ისა და Freeze-ის მიერ იელოუსტოუნში აღმოჩენა; Taq პოლიმერაზის1976 წელს Chien-ის, Edgar-ისა და Trela-ს მიერ გაწმენდა და მისი ოპტიმალური ტემპერატურა; Taq-ის ნახევარდაშლის დრო95 °C-ზე და შეცდომის სიხშირე; Mullis-ის მიერ ნობელის ლექციაში Science -ის უარის პირადად აღწერა;1988 წლის Science Taq სტატია; „Mr. Cycle“ და TC1 DNA Thermal Cycler;1993 წლის ნობელის პრემიის ქიმიაში განაწილება და დასაბუთება; Mullis-ის შეხედულებები HIV-AIDS-ზე, კლიმატსა და ასტროლოგიაზე, გარდაცვალების თარიღი და ასაკი;1992 წლის Higuchi-ს კვლევა;1999 წელს Vogelstein-ისა და Kinzler-ის მიერ ციფრული PCR ტერმინის შემოტანა და მითითებული მგრძნობელობის მაჩვენებლები; კლინიკური ddPCR სისტემის2017 წლის CE და2019 წლის FDA დამტკიცება; Oncotype DX-ის21 გენი /16+5 სტრუქტურა და RT-PCR მეთოდი (მწარმოებლის გვერდი); TAILORx-ისა და RxPONDER-ის შედეგები (NCI-ისა და SWOG-ის განცხადებები); BCR-ABL1 მოლეკულური პასუხის განსაზღვრებები; FDA-ის14 მაისი2024 თარიღის HPV თვითნიმუშაღების დამტკიცება; Aptima-ს E6/E7 mRNA ტესტად დადასტურება; ACS2020 სკრინინგის რეკომენდაცია; MGMT მეტაანალიზის მონაცემები; FDA-ის თანმხლები დიაგნოსტიკური ტესტების სიაში მწარმოებლის, PMA-სა და პრეპარატის შესაბამისობები; მწარმოებლის მიერ აღწერილი Signatera-ს მეთოდი და რეგულაციური სტატუსი; თურქეთის საშვილოსნოს ყელის სკრინინგის სტანდარტების ტექსტი.
დაუდასტურებელი: გენეტიკური კოდის გაშიფვრის წლების (1961, 1966) პირველწყარო; Kornberg-ის1956 წლის კვლევის თანაავტორები და წყარო ორგანიზმის ნათელი დადასტურება; „Mr. Cycle“-ის შემქმნელი ინჟინრების სახელები; TaqMan ქიმიის შემმუშავებლები და პირველი კომერციული რეალური დროის მოწყობილობის თარიღი; Higuchi-ს1992 წლის დაწესებულება; LAMP მეთოდის შემქმნელი და წელი (ამიტომ სტატიაში LAMP არ შევიდა); პანდემიის დროს მსოფლიოში ჩატარებული ტესტების საერთო რაოდენობა; FDA-ის მიერ დამტკიცებული PCR ტესტების საერთო რაოდენობა; თანმხლები დიაგნოსტიკური ტესტების დამტკიცების წლები (ამიტომ ცხრილში არ შევიდა); ქრონიკული მიელოიდური ლეიკემიისას მკურნალობის შეწყვეტის ცდისთვის საჭირო პასუხის სიღრმე და ხანგრძლივობა; პირველწყაროდან იმის დადასტურება, რომ cobas HPV რეალური დროის PCR ტესტია; PCR-ისა და ახალი თაობის სეკვენირების დროის, ღირებულებისა და მგრძნობელობის შედარების ავტორიტეტული რიცხვები; გლიობლასტომის დროს MGMT სტატუსის მიხედვით გადარჩენის მაჩვენებლები; თურქეთის საშვილოსნოს ყელის სკრინინგის პროგრამის მიმდინარე მუშაობა, ტესტების ბრენდები და მოცვის მაჩვენებლები; SGK-ის ანაზღაურების სტატუსი (არანაირი მტკიცება არ კეთდება).
შესწორებების ბუნება: სტატიაში რვაპუნქტიანი შესწორებების ცხრილი ამ სტატიის წინა ვერსიასა და გავრცელებულ თურქულ წყაროებში არსებული ფორმულირებების პირველ და მეორეულ წყაროებთან შედარებიდან წარმოიშვა. დასკვნა, რომ „15 ჟურნალმა უარი თქვა“ მტკიცება მხარდაჭერილი არაა, ჩვენ გვეკუთვნის: ამ მტკიცების მხარდამჭერი სანდო წყარო ვერ მოიძებნა, ხოლო ორი უარი (Nature და Science) დოკუმენტირებულია. შეფასება, რომ Mullis-ის სამეცნიერო მეთოდი მისი პირადი შეხედულებებისგან უნდა გაიმიჯნოს, ასევე ამ სტატიას ეკუთვნის.
ინტერესების დეკლარაცია: ამ სტატიაში ნახსენებ არცერთ ტესტთან, მოწყობილობასთან ან მწარმოებელ კომპანიასთან კავშირი არ გვაქვს.
წყაროები
- Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. „β-გლობინის გენომური თანმიმდევრობების ფერმენტული გამრავლება და შეზღუდვის უბნების ანალიზი ნამგლისებრუჯრედოვანი ანემიის დიაგნოსტიკისთვის.“ Science 1985;230(4732):1350–1354.
- Mullis KB, Faloona FA. „DNA-ის სპეციფიკური სინთეზი ინ ვიტრო პოლიმერაზით კატალიზებული ჯაჭვური რეაქციის საშუალებით.“ Methods in Enzymology 1987;155:335–350.
- Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. „პრაიმერით მიმართული DNA-ის ფერმენტული გამრავლება თერმოსტაბილური DNA პოლიმერაზით.“ Science 1988;239(4839):487–491.
- Chien A, Edgar DB, Trela JM. „დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავის პოლიმერაზა ექსტრემალური თერმოფილიდან Thermus aquaticus." Journal of Bacteriology 1976;127(3):1550–1557.
- ნობელის პრემია ქიმიაში1993 — Kary B. Mullis და Michael Smith. nobelprize.org
- Mullis KB. ნობელის ლექცია,8 დეკემბერი1993. nobelprize.org
- ნობელის პრემია ფიზიოლოგიასა ან მედიცინაში1968 — Holley, Khorana, Nirenberg. nobelprize.org
- ნობელის პრემია ფიზიოლოგიასა ან მედიცინაში1959 — Ochoa, Kornberg. nobelprize.org
- Higuchi R, და თანაავტორები. „სპეციფიკური DNA თანმიმდევრობების ერთდროული გამრავლება და გამოვლენა.“ Bio/Technology 1992.
- Vogelstein B, Kinzler KW. ციფრული PCR კონცეფციის განსაზღვრა,1999.
- National Cancer Institute. „TAILORx კვლევა: ქიმიოთერაპია ადრეული ძუძუს კიბოს მქონე მრავალი ქალისთვის სასარგებლო არაა.“ პრესრელიზი,2018. cancer.gov
- SWOG Cancer Research Network. RxPONDER-ის შედეგების NEJM-ში გამოქვეყნების განცხადება,3 დეკემბერი2021. swog.org
- Exact Sciences. Oncotype DX Breast Recurrence Score — გვერდი ჯანდაცვის პროფესიონალებისთვის. exactsciences.com
- U.S. Food and Drug Administration. „ნებადართული ან დამტკიცებული თანმხლები დიაგნოსტიკური მოწყობილობების სია (ინ ვიტრო და ვიზუალიზაციის ინსტრუმენტები).“ fda.gov
- National Cancer Institute. „FDA ამტკიცებს HPV ტესტებისთვის თვითნიმუშაღებას.“ Cancer Currents Blog,2024. cancer.gov
- American Cancer Society. საშვილოსნოს ყელის კიბოს სკრინინგის სახელმძღვანელო,2020. pressroom.cancer.org
- Hologic. Aptima HPV ტესტის პროდუქტის ინფორმაცია — E6/E7 mRNA. hologic.com
- MGMT პრომოტორის მეთილაციის მეთოდების შედარებითი მეტაანალიზი. Neuro-Oncology 2021;23(9):1457.
- Natera. Signatera — კლინიცისტის საინფორმაციო გვერდი. natera.com
- National Cancer Institute. „ბიომარკერების ტესტირება კიბოს მკურნალობისთვის.“ cancer.gov
- თურქეთის რესპუბლიკის ჯანდაცვის სამინისტრო. საშვილოსნოს ყელის კიბოს სკრინინგის პროგრამის ეროვნული სტანდარტები.
- Brock TD, Freeze H. Thermus aquaticus-ის იზოლირება,1969.
ეს სტატია სასარგებლო იყო თქვენთვის?
თქვენი გამოხმაურება გვეხმარება შინაარსის გაუმჯობესებაში.
მკითხველთა კომენტარები
გაგვიზიარეთ თქვენი კომენტარი
თქვენი სახელი და კომენტარი მხოლოდ ადმინისტრატორის დამტკიცების შემდეგ გამოქვეყნდება. ელფოსტის მისამართი ვიზიტორებს არასოდეს ეჩვენებათ.
პირველმა დაწერეთ კომენტარი.