Что такое полимеразная цепная реакция? История PCR, проведение и медицинское значение
В этой статье
Полимеразная цепная реакция (PCR) — метод, позволяющий миллионы раз копировать фрагмент ДНК в лаборатории. Идея, возникшая во время ночной поездки в 1983 году, за сорок лет стала основой генетической диагностики, выбора лечения рака, судебной медицины и тестовой инфраструктуры глобальной пандемии. Эта статья объясняет PCR с самого начала и с указанием источников исправляет несколько распространенных заблуждений.
Проще всего понять PCR по аналогии: у вас есть одна страница, слишком бледная для чтения. PCR делает миллиарды ксерокопий и позволяет ее прочитать. Но с важным отличием: копировальный аппарат копирует всю страницу, а PCR — только отмеченный вами абзац размножает. Разметку выполняют праймерами называемые короткие синтетические фрагменты ДНК. Эта избирательность превращает метод из средства копирования в диагностический инструмент по своему назначению.
В онкологии PCR — не абстрактная лабораторная техника. Тест из 21 гена, определяющий необходимость химиотерапии при раке молочной железы, является RT-PCR. При хроническом миелоидном лейкозе ответ пациента на лечение измеряют PCR. Тест HPV для скрининга рака шейки матки основан на PCR. Тест EGFR, определяющий выбор таргетного препарата при раке легкого, — PCR. То есть в онкологии PCR не «фоновая технология», а само решение о лечении.
Что такое PCR в одном предложении? Экспоненциальное размножение последовательности ДНК, ограниченной с двух концов синтетическими праймерами, циклами нагревания и охлаждения с термостойкой ДНК-полимеразой. Теоретически число копий удваивается в каждом цикле; после 30 циклов из одной молекулы получают примерно один миллиард копий.
Как работает PCR? Три этапа
Вся PCR состоит в изменении температуры в определенном порядке. В пробирке находятся целевая ДНК, два праймера, ДНК-полимераза, четыре нуклеотида (A, T, G, C) и подходящий буфер. Прибор — термоциклер — автоматически меняет температуру пробирки.
| Этап | Температура | Время | Что происходит? |
|---|---|---|---|
| 1. Денатурация | 94–98 °C | 20–30 секунд | Водородные связи, удерживающие двойную спираль, разрываются; две цепи разделяются. |
| 2. Отжиг праймеров (annealing) |
50–65 °C | 20–40 секунд | Синтетические праймеры связываются с обоими концами целевого участка, ограничивая область размножения. |
| 3. Элонгация (extension) |
72 °C | Зависит от длины | ДНК-полимераза синтезирует новую цепь, начиная с конца праймера. |
Эти три этапа повторяют 25–40 раз. Теоретически количество копий удваивается в каждом цикле.
Поправка: температура отжига — не «37–65 °C». В интернете и многих турецких источниках температуру отжига праймеров приводят как диапазон от 37 °C. Это сведения, относящиеся к первым годам PCR, периоду 1983–1985 с нетермостойким ферментом Кленова по своему происхождению. В современной PCR температура отжига примерно на 3–5 °C ниже температуры плавления праймеров (Tm) устанавливается; поскольку типичные праймеры из 18–25 нуклеотидов имеют Tm 55–65 °C, практический диапазон — 50–65 °C. Работа при 37 °C приводит к связыванию праймеров не с теми участками, то есть к неспецифическим продуктам. Различие не академическое: в диагностике это означает ложноположительный результат.
Почему термостойкий фермент обязателен?
В первоначальной PCR была серьезная практическая проблема. В каждом цикле для разделения ДНК пробирку нагревали до 94 °C; эта температура разделяла ДНК, но также разрушала фермент. Поэтому в начале каждого цикла приходилось открывать пробирку и вручную добавлять новый фермент. Опыт из 30 циклов означал 30 ручных добавлений фермента — автоматизация была невозможна.
Решение пришло от бактерии, живущей в горячих источниках. Thermus aquaticusДНК-полимераза этой бактерии — сокращенно Taq-полимераза — лучше всего работает при 75–80 °C и даже при 95 °C имеет период полураспада примерно 40 минут. С включением Taq в PCR открывать пробирку больше не понадобилось: процесс полностью автоматизировали. Именно этот шаг превратил PCR из лабораторного трюка в промышленный стандарт по своему статусу.
У Taq есть слабость: у нее нет корректирующей активности 3'→5' (proofreading), то есть она не может вернуться и исправить ошибку копирования. Для исходного фермента сообщается частота ошибок примерно одна на 9.000 нуклеотидов. Для большинства диагностических применений это не проблема, но для секвенирования или клонирования, где важна каждая буква, предпочитают другие термостойкие полимеразы с коррекцией (например, Pfu, Phusion). «Провели PCR» не означает применение одного метода с одним ферментом.
История PCR — и восемь распространенных ошибок
Историю PCR турецкие источники в основном описывают верно, но несколько дат и одна легенда постоянно повторяются. Следующая таблица сопоставляет распространенные в интернете утверждения, присутствовавшие и в прежней версии этой статьи, с проверенными сведениями.
| Распространенное утверждение | Правильные сведения |
|---|---|
| «Представлена в 1985 году Erlich, Mullis и Saiki» | У статьи семь авторов, первый автор — Saiki: Saiki, Scharf, Faloona, Mullis, Horn, Erlich, Arnheim. Science 1985;230(4732):1350–1354. |
| «В 1966 году Nirenberg, Khorana и Holley расшифровали генетический код и синтезировали искусственный ген; Khorana получил за это Нобелевскую премию» | Нобелевская премия 1968в этом году была вручена за «интерпретацию генетического кода и его функции в синтезе белка», а не за искусственный ген. Первый полный синтез гена Khorana осуществил в 1972году, на четыре года позже. |
| «Taq-полимераза, открытая в 1976 году, получена из Thermus aquaticusэтой бактерии» | Здесь объединены два разных события. Бактерия в 1969 году была обнаружена Thomas Brock и Hudson Freeze в Йеллоустоуне. Фермент в 1976 году был очищен Chien, Edgar и Trela (J Bacteriol 1976;127:1550–1557). |
| «Фермент, выдерживающий 94 °C» | Верно, но неполно: у Taq оптимальная рабочая температура 75–80 °Cсоставляет; при 95 °C период полураспада примерно 40 минут, при 92,5 °C — более 2 часов. |
| «Статью отклонили примерно 15 журналов» | Не подтверждается. Документированы два отказа: Nature и Science. Mullis сам рассказывает об отказе Science в Нобелевской лекции. Методическая статья в 1987 году Methods in Enzymologyбыла опубликована. Надежного источника для «15 журналов» не найдено. |
| «В 1986 году Taq-полимеразу добавили в PCR» | Статья с описанием PCR с Taq датируется 1988 годом: Saiki и др., Science 1988;239(4839):487–491. |
| «Через год Perkin Elmer разработала термоциклер» | Порядок перепутан. Прототип Cetus «Mr. Cycle» 1985–86в этот период был создан; первый коммерческий прибор Perkin-Elmer Cetus — TC1 DNA Thermal Cycler— появился в 1987году. То есть прибор появился раньше статьи о Taq. |
| «Отжиг праймеров 37–65 °C» | В современной PCR 50–65 °C; на 3–5 °C ниже Tm праймера. 37 °C относится к периоду 1983–85 с ферментом Кленова. |
Самая поучительная из этих поправок — пятая. История «статью гения отклонили 15 журналов» — любимый шаблон научной коммуникации: система слепа, одиночка прав. Реальная история интереснее и реалистичнее — два крупных журнала отказали, метод опубликовали в методическом журнале, а прикладная статья 1985 года, обеспечившая настоящий прорыв, уже вышла в Scienceк тому времени. То есть система не была слепа: сама идея не казалась убедительной, пока не показали ее работоспособность. Это гораздо точнее отражает работу науки, чем легенда о «15 отказах».
Ночь появления идеи
По словам самого Mullis, идея пришла ему весной 1983 года в пятницу ночью по дороге из Беркли в хижину в северной Калифорнии на шоссе номер 128 . Он остановился, достал бумагу из бардачка и записал мысль. В Нобелевской биографии этот момент описан как «когда цвели калифорнийские конские каштаны». Первую успешную демонстрацию метода датируют 16 декабря 1983 года.
Суть идеи проста — и именно поэтому никому не пришла в голову: ДНК-полимераза уже была известна (1956), праймеры уже умели синтезировать, разделение ДНК нагреванием тоже было известно. Mullis не открыл новую молекулу, а объединил три известные вещи в цикл. Отсюда возникло экспоненциальное размножение.
Первое опубликованное применение было диагностическим тестом. В 1985 году статья Science посвящалась не фундаментальной биологии, а диагностике серповидноклеточной анемии: размножению гена β-глобина и исследованию рестрикционным анализом. PCR представили миру не как исследовательский инструмент, а непосредственно как инструмент клинической диагностики по своему назначению. Через сорок лет, учитывая место метода в онкологии, такое начало выглядит закономерным.
Kary Mullis: отделять метод от человека
Mullis разделил Нобелевскую премию по химии 1993 года с Michael Smith ; Smith наградили за работы по сайт-направленному мутагенезу (site-directed mutagenesis). Обоснование Mullis состояло из одного предложения: «за изобретение метода полимеразной цепной реакции».
Однако поздние годы Mullis — один из тревожных примеров истории науки. Документально известно, что он отрицал, что HIV вызывает AIDS , хотя не имел исследовательского опыта ни в одной из этих двух областей. Он преуменьшал антропогенное изменение климата и истончение озонового слоя, утверждал, что ученые сговариваются ради финансирования. Заявлял о вере в астрологию, а в автобиографии описал встречу с светящимся говорящим енотом , которого считал, возможно, внеземным существом. Он умер 7 августа 2019 года в возрасте 74 лет от осложнений пневмонии.
Писать об этом необходимо, поскольку противоположное рассуждение очень распространено. Фразу «изобретатель PCR отрицал связь HIV–AIDS» во время пандемии многократно использовали для дискредитации тестов PCR. Рассуждение ошибочно в обоих направлениях: Нобелевская премия не делает человека правым во всем; ошибки человека в других вопросах не означают недействительность его метода. PCR действительна независимо от взглядов Mullis, потому что сорок лет дает воспроизводимые результаты в миллионах экспериментов. Метод держится не авторитетом изобретателя, а воспроизводимостью по своей основе. Это различие — подходящий фильтр и для встречающихся онкологическим пациентам заявлений вроде «известный ученый сказал такое-то».
PCR — не один метод: четыре поколения
PCR 1980-х и PCR современной онкологической лаборатории — не одно и то же. Метод развивался в четырех поколениях, каждое из которых возникло для ответа на вопрос, недоступный предыдущему.
| Поколение | Год | Вопрос, на который отвечает | Способ измерения |
|---|---|---|---|
| Классическая PCR (по конечной точке) | 1983–85 | «Есть эта последовательность или нет?» | После завершения циклов смотрят наличие полосы в геле — качественное |
| RT-PCR (обратная транскрипция) |
Конец 1980-х | «Есть эта RNA ? Насколько выражена экспрессия этого гена?» | RNA сначала превращают в cDNA, затем размножают |
| PCR в реальном времени (qPCR) | 1992 | «Сколько имеется?» | В каждом цикле измеряют флуоресценцию — относительное количественное |
| Цифровая PCR (dPCR/ddPCR) | 1999 (концепция) | «Сколько молекул? Можно ли найти среди 100.000 нормальных молекул 1 мутантную?» | Образец делят на тысячи капель, считают положительные капли — абсолютное количественное |
PCR в реальном времени (qPCR) и значение Ct
Проблема классической PCR: результат смотрели после завершения реакции, когда материал пробирки уже истощился, а размножение вышло на плато. При исходных 10 и 10.000 копиях конечные полосы были похожи. То есть на вопрос «есть ли» ответить было возможно, а на вопрос «сколько имеется» — нет.
Опубликованная в 1992 году работа Higuchi и коллег изменила это: наблюдать размножение не после завершения, а в процессе его протекания. В пробирку помещают флуоресцентную систему, и прибор в каждом цикле измеряет свет. В широко применяемой химии TaqMan есть связывающийся с мишенью зонд: на одном его конце светящаяся молекула, на другом — подавляющий ее гаситель (quencher). При удлинении Taq-полимераза встречает зонд и расщепляет его, концы разделяются, и свет освобождается. Рост сигнала пропорционален количеству размножения.
Что такое Ct (или Cq)? Это номер цикла, в котором флуоресцентный сигнал пересекает порог (threshold cycle / quantification cycle; руководство MIQE предпочитает термин «Cq»). Логика обратная, что часто путают: Чем ниже Ct, тем больше исходное количество мишени. Потому что реакция, начавшаяся с большого количества копий, раньше пересекает порог. Отсюда во время пандемии обсуждали «у меня Ct 32, мало ли вируса?» — причем большинство обсуждений не учитывало, что Ct относительное число, зависящее от прибора и протокола по своему характеру.
Цифровая PCR: измерять подсчетом
qPCR измеряет относительно: сообщает «во столько-то раз больше» относительно эталона. Цифровая PCR использует иную логику: делит образец на тысячи малых отсеков (капель), так что в каждый попадает либо одна молекула-мишень, либо ни одной. После циклов количество положительных отсеков она считает. С помощью статистики Пуассона непосредственно вычисляют исходное число молекул — без необходимости стандартной кривой.
Название концепции в 1999 году дали Bert Vogelstein и Kenneth Kinzler , а первое показанное ими применение непосредственно касалось темы этой статьи: обнаружение редких раковых мутаций. Были и предшественники: исследователи Cetus в 1988 году показали обнаружение одной копии β-глобина разведением, а Morley и Sykes в 1992 году превратили предельное разведение в количественный метод.
Значение цифровой PCR в онкологии определяется одной особенностью: способностью находить редкое. Заявленная результативность такова: мутантная ДНК обнаруживается среди нормальной ДНК в 200.000-кратном избытке ; сообщается, что относительно классической qPCR чувствительность примерно в 2.000 раз выше; одна на 1.250.000 клеток настолько редкие последовательности можно обнаружить. Поскольку доля циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) во всей свободной ДНК часто ниже одной тысячной, такая чувствительность — не роскошь, а необходимое условие. Первая разрешенная для клинического применения капельная цифровая система PCR получила знак CE в 2017 году, одобрение FDA для хронического миелоидного лейкоза в 2019 году по своему назначению.
RT-PCR и пандемия
RNA нельзя размножать напрямую: сначала ее нужно преобразовать в ДНК (cDNA) обратной транскриптазой. Метод с этим дополнительным этапом называется RT-PCR . Поскольку SARS-CoV-2 — RNA-вирус, тест построили по той же логике: сначала обратная транскрипция, затем размножение в реальном времени, то есть RT-qPCR. Возможность обнаруживать и количественно измерять в одном закрытом запуске сделала его эталонным тестом.
Самый долговременный урок пандемии для PCR касается не силы, а ограничения метода. PCR обнаруживает целевую последовательность, но не говорит, принадлежит ли она живому заразному организму . Поэтому фрагменты вирусной RNA, обнаруживаемые неделями после инфекции, могли давать положительный результат. То же ограничение действует и в онкологии, хотя обсуждается реже: PCR показывает наличие мутации, но не показывает, растит ли опухоль клетка с этой мутацией. Правильное использование требует знать не только то, что метод говорит, но и чего он не говорит по своей сути. Надежную цифру общего мирового количества тестов во время пандемии для этой статьи проверить не удалось, поэтому число не приводится.
PCR в онкологии: четыре конкретных примера
Место PCR в онкологии гораздо шире, чем «используется в исследованиях». Следующие четыре примера — ситуации, когда результат PCR становится непосредственно решением о лечении по своему значению.
1. Решение о химиотерапии при раке молочной железы: Oncotype DX
При раннем гормон-рецептор-положительном, HER2-отрицательном раке молочной железы один из труднейших вопросов: нужна ли пациентке послеоперационная химиотерапия? Тест Oncotype DX Breast Recurrence Score ищет ответ по экспрессии генов в опухолевой ткани. По определению производителя тест оценивает экспрессию 21 гена по своему принципу — 16 генов, связанных с раком, и 5 референсных генов — используя для этого «полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR) для анализа опухолевой RNA» в качестве метода. Образец — ткань, взятая при трепанобиопсии или хирургическом удалении.
| Исследование | Пациенты | Популяция | Результат |
|---|---|---|---|
| TAILORx | 10.273 | Отрицательные лимфоузлы, рандомизированы пациентки с оценкой 11–25 | Инвазивная безрецидивная выживаемость через 9 лет %83,3 (только эндокринная терапия) — %84,3 (эндокринная + химиотерапия); общая выживаемость %93,9 – %93,8. То есть преимущества химиотерапии нет. Исключение: в возрасте 50 лет и младше при оценке 16–25 отмечена небольшая польза. |
| RxPONDER | 5.083 | 1–3 положительных лимфоузла, оценка ≤25 | Инвазивная безрецидивная выживаемость через 5 лет — после менопаузы: %91,9 против %91,3 (различия нет); до менопаузы: %89,0 против %93,9 (в пользу химиотерапии). |
Источники: пресс-релиз NCI (TAILORx) и сообщение SWOG (RxPONDER).
Главная новость здесь не то, кому тест назначает химиотерапию, а кому не назначает. Результат TAILORx позволил десяткам тысяч женщин с отрицательными лимфоузлами и промежуточной оценкой избежать химиотерапии и ее постоянных побочных эффектов — благодаря RT-PCR-тесту. А RxPONDER показал противоположные результаты в зависимости от менопаузы, продемонстрировав, что одно число имеет неодинаковое значение для разных пациенток. Клинические подробности решения рассмотрены в статье пациентки, которым не нужна химиотерапия после операции по поводу рака молочной железы , а сравнение геномных тестов — в статье геномные тесты оценки рецидива при дольковом раке молочной железы на нашем сайте.
2. Измерение ответа при хроническом миелоидном лейкозе: BCR-ABL1
Хронический миелоидный лейкоз — заболевание, где PCR наиболее глубоко укоренилась в онкологии. Драйвер заболевания — BCR-ABL1 химерный транскрипт — измеряют количественной RT-PCR, а результат сообщают по Международной шкале (International Scale, IS) в отчете. Успех лечения здесь определяется не «уменьшилась ли опухоль», а тем, на сколько логарифмов снизилось число по результатам измерения.
| Уровень | Определение | Значение |
|---|---|---|
| %1 IS | BCR-ABL1 ≤ %1 | Эквивалент полного цитогенетического ответа |
| MMR / MR3 | BCR-ABL1 ≤ %0,1 | Относительно исходного уровня 3 log снижение — большой молекулярный ответ |
| MR4 | ≤ %0,01 или неопределяемый при >10.000 транскриптов ABL1 | Снижение на 4 log |
| MR4.5 | ≤ %0,0032 или неопределяемый при >32.000 транскриптов ABL1 | Снижение на 4,5 log |
| MR5 | ≤ %0,001, при >100.000 транскриптов ABL1 | Снижение на 5 log |
Контрольные рубежи ответа обычно оценивают на 3-м, 6-м и 12-м месяцах лечения. Числа транскриптов в определениях — требование чувствительности теста: чтобы сообщать MR4.5, лаборатория должна размножить не менее 32.000 контрольных транскриптов.
Эта таблица — самое яркое свидетельство достигнутой чувствительности PCR. Надежно измерять долю три на десять тысяч означает считать несколько молекул на миллион; такое измерение проводят каждые три месяца в обычной больничной лаборатории. Глубокий устойчивый молекулярный ответ позволяет некоторым пациентам рассматривать пробную отмену ингибитора тирозинкиназы (ремиссию без лечения). Но требуемые глубину и продолжительность ответа для пробной отмены для этой статьи проверить не удалось; решение принадлежит гематологу, и числовой порог здесь не приводится.
3. Тест HPV при скрининге рака шейки матки
За последние двадцать лет скрининг рака шейки матки перешел от изучения клеток (цитология/мазок) к изучению нуклеиновой кислоты вируса по своему принципу. Руководство Американского онкологического общества 2020 года прямо рекомендует: «В возрасте от 25 до 65 лет предпочтительный метод — первичный тест HPV каждые пять лет (тест HPV без Pap-теста)» как подход; совместное тестирование (co-testing) и отдельная цитология сохраняются как «приемлемые альтернативы», поскольку доступ к одобренному для первичного скрининга тесту HPV возможен не везде.
Здесь необходимо различать: не все тесты HPV являются PCR. Тест Aptima HPV обнаруживает не ДНК вируса, а E6/E7 mRNA и использует другую химию амплификации. Это существенно: обнаружение mRNA претендует показать не только присутствие вируса, но и то, что его онкогены активны по своей функции.
Новое достижение: самостоятельный забор образца. FDA 14 мая 2024 года для двух тестов HPV — BD Onclarity HPV и Roche cobas HPV — разрешило самостоятельный забор образца женщиной. Разрешение охватывает получение образца «в медицинской среде, например кабинетах первичного приема, центрах неотложной помощи, аптеках и мобильных клиниках» как местах забора. Это важный рубеж для женщин, никогда не проходящих скрининг из-за опасений гинекологического осмотра. Предотвращение рака шейки матки скринингом мы подробно рассмотрели в статье о раке шейки матки на нашем сайте.
4. Прогнозирование ответа при глиобластоме: метилирование MGMT
Метилирование промотора гена MGMT при глиобластоме предсказывает вероятность пользы от химиотерапии темозоломидом. Основной метод определения — метилирование-специфическая PCR (methylation-specific PCR, MSP), второй — пиросеквенирование (pyrosequencing, PSQ).
Neuro-Oncology опубликованный в этом журнале метаанализ на основе Cochrane количественно показывает преобладание метода: примерно в 190 исследованиях с одной техникой (27.710 участников) 94 исследования использовали MSP, 27 — пиросеквенирование как метод. При сравнении прогностической силы у получающих темозоломид пациентов с глиобластомой относительно иммуногистохимии отношение отношений рисков (RHR) MSP составило 1,31 (%95 ДИ 1,01–1,71), а для пиросеквенирования — 1,36 (1,01–1,84) ; различие пиросеквенирования и MSP не было значимым (1,14; 0,87–1,48). Что касается порога, для участков CpG 74–78 %9порог работал лучше более высоких порогов %28–29, как сообщалось.
Последняя фраза показывает малообсуждаемую сторону молекулярных тестов: исследуя один образец одним методом, разный порог использующие две лаборатории могут дать одному пациенту разные результаты. Фраза «MGMT метилирован» неполна без знания метода и порога. Как молекулярная диагностика определяет лечение глиобластомы, рассмотрено в статьях молекулярная диагностика глиобластомы и высокозлокачественная глиома с диким типом IDH на нашем сайте.
Сопутствующие диагностические тесты на основе PCR (companion diagnostics)
В официальном списке FDA сопутствующих диагностических тестов много PCR-тестов, названных в инструкции препарата и определяющих его получателей. Следующие примеры взяты непосредственно из этого списка.
| Тест | Производитель | Номер PMA | Связанный препарат (препараты) |
|---|---|---|---|
| cobas EGFR Mutation Test v2 | Roche Molecular Systems | P120019 | Осимертиниб, эрлотиниб, гефитиниб, афатиниб |
| therascreen KRAS RGQ PCR Kit | QIAGEN | P140022 | Цетуксимаб, панитумумаб |
| cobas KRAS Mutation Test | Roche Molecular Systems | P140023 | Цетуксимаб, панитумумаб |
| therascreen PIK3CA RGQ PCR Kit | QIAGEN | P180001 | Алпелисиб |
| cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test | Roche Molecular Systems | P110020 | Вемурафениб; позднее кобиметиниб |
| therascreen BRAF | QIAGEN | P130010 | Вемурафениб |
Производитель, номер PMA и связанные препараты взяты из списка сопутствующих диагностических тестов FDA. Годы одобрения не приведены, поскольку для этой статьи их не удалось проверить по отдельности — дату каждого теста можно проверить по номеру PMA на accessdata.fda.gov.
Таблица наглядно обобщает роль PCR в онкологии: при раке легкого какому пациенту назначить ингибитор EGFR, при колоректальном раке какому пациенту не назначать антитело против EGFR, при меланоме кто подходит для ингибитора BRAF — все зависит от результата PCR. Вид карциномы определяющего патологического заключения теперь недостаточно: рядом необходим молекулярный отчет.
Жидкостная биопсия и минимальная остаточная болезнь: эпоха PCR заканчивается?
По циркулирующей в крови опухолевой ДНК (ctDNA) определять, осталась ли после операции микроскопическая болезнь, — то есть минимальной остаточной болезни (MRD) мониторинг — одно из самых быстрорастущих направлений онкологии. Учитывая чувствительность цифровой PCR к редким вариантам, можно ожидать ее естественного господства здесь. Реальность сложнее.
Нужно исправить распространенную ошибку. Signatera, один из широко используемых опухоль-информированных MRD-тестов, часто описывают как «персонализированную мультиплексную PCR». Но актуальная страница производителя для врачей определяет тест так: по опухолевой ткани полному экзомному или полногеномному секвенированию создают персональную панель, 64 клональных варианта выбирают и ищут их в крови с помощью «ультраглубокого секвенирования с глубиной до 350.000 для каждого выбранного варианта» как метода. То есть этап считывания — секвенирование, а не PCR. На той же странице прямо указано, что тест не одобрен FDA («не получили разрешения или одобрения Управления по контролю пищевых продуктов и лекарств США»); лаборатория аккредитована CLIA и CAP, а тест покрывается Medicare для наблюдения за прогрессированием, рецидивом и возвратом болезни.
Вывод не в отступлении PCR, а в изменении разделения труда. Когда вы не знаете, какие мутации есть в опухоли, необходимо секвенирование: PCR находит только то, что вы ищете. Но какую мутацию искать, когда вы знаете, PCR быстрее, дешевле и часто достаточно чувствительна. Клиническое значение изменения лечения по ctDNA рассмотрено в статьях исследование GALAXY и в SERENA-6 смена лечения по мутации ESR1 ; скрининг по анализу крови — в статье скрининг рака толстой кишки на основе фрагментомики и метилирования на нашем сайте.
PCR или секвенирование нового поколения?
Вопрос частый и обычно поставлен неверно. Это не соперники, а инструменты для разных вопросов. По формулировке Национального института рака, одни биомаркерные тесты «изучают один биомаркер», другие «изучают много биомаркеров одновременно и могут называться многогеновыми или панельными тестами»; некоторые читают весь экзом или геном.
| Тест на основе PCR | Секвенирование нового поколения (NGS) | |
|---|---|---|
| Основная логика | Находит искомое | Читает имеющееся |
| Мишень | Заранее определенное ограниченное число вариантов | Широкая панель, экзом или геном |
| Неизвестный вариант | Не видит — праймер не разработан | Может увидеть |
| Регуляторный статус | Может быть сопутствующим диагностическим тестом, названным в инструкции препарата | Есть и одобрения широких панелей |
| Типичное применение | Принять одно решение | Составить карту |
Примечание: В таблице намеренно нет сравнения времени, стоимости и чувствительности. При подготовке статьи не удалось подтвердить авторитетным источником широко распространенные цифры по этим вопросам; вместо предположений оставлены пробелы.
Структурный аргумент таков: FDA и сегодня продолжает одобрять PCR-тесты отдельных вариантов как сопутствующие диагностические тесты, названные в инструкциях препаратов. Если бы секвенирование полностью заменило PCR, строки PCR исчезли бы из списка. Они не исчезают. Секвенирование — для карты мутаций, PCR — для решения по известной мутации: оба работают вместе. Значение местоположения мутации в гене показывающие исследования тоже являются результатом именно этого двухслойного подхода.
Ограничения PCR и источники ошибок
Нельзя правильно использовать метод, не зная его ограничений. Наиболее частые клинические проблемы PCR:
Сила PCR — ее слабость: поскольку можно размножить даже одну молекулу, попавший в воздух продукт предыдущей реакции способен дать ложноположительный результат. Поэтому в молекулярных лабораториях обязательны отдельные комнаты и однонаправленный рабочий поток.
Гемоглобин крови, остатки формалина в ткани или гепарин могут подавлять фермент. Результат ложноотрицательный, и без внутреннего контроля это незаметно.
PCR видит только последовательность, для которой разработан праймер. Мутация вне панели сообщается как «мутации нет». Это означает, что отрицательный результат всегда нужно читать внимательно.
Taq без корректирующей активности делает примерно одну ошибку на 9.000 нуклеотидов. Для диагностики это несущественно, для размножения перед секвенированием — существенно.
В парафиновых тканях ДНК фрагментирована. Длинные мишени не размножаются. Неудача теста часто является проблемой не метода, а образца по своему происхождению.
PCR находит последовательность, но не показывает, жив ли организм-владелец и активна ли клетка. Интерпретация всегда требует клинического контекста.
Применения PCR
| Область | Применение |
|---|---|
| Онкология | Сопутствующие диагностические тесты (EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA) |
| Оценки рецидива по экспрессии генов (RT-PCR-тест из 21 гена) | |
| Мониторинг молекулярного ответа при гематологических опухолях (BCR-ABL1) | |
| Определение статуса метилирования (MGMT) | |
| Генетика | Носительство и диагностика наследственных заболеваний |
| Дородовая (пренатальная) диагностика | |
| Предимплантационное генетическое тестирование при ЭКО | |
| Инфекция | Обнаружение вирусных и бактериальных патогенов |
| Измерение вирусной нагрузки (HIV, HBV, HCV) | |
| Скрининг рака шейки матки на основе HPV | |
| Судебная медицина | Идентификация личности и установление отцовства |
| Получение профиля ДНК из очень малого образца | |
| Исследования | Клонирование, размножение перед секвенированием |
| Изучение взаимодействий ДНК–белок | |
| Эволюционная биология и исследования древней ДНК | |
| Пищевая отрасль и промышленность | Определение вида и контроль фальсификации |
| Выявление аллергенов и генетически модифицированных организмов |
Ситуация в Турции
Тест HPV в национальной программе скрининга
В турецком документе Национальные стандарты программы скрининга рака шейки матки скрининг определяется так: «популяционный скрининг женщин, начинающийся в 30 лет и заканчивающийся в 65 лет» и «идеальный метод — скрининг тестом HPV или Pap-мазком каждые пять лет». Тест «тест HPV или Pap-мазок повторяется каждые пять лет» этой формулировкой закреплен за пятилетним интервалом.
Забор образцов выполняет «работающий в ASM или TSM (KETEM) медицинский персонал, прошедший обучение в этой области» ; взятые образцы отправляют «в подходящих условиях фиксации в центры исследования, определенные Турецким учреждением общественного здравоохранения или управлениями общественного здравоохранения» для исследования. То есть программа построена на централизованной лабораторной структуре — техническом условии популяционного применения HPV-теста.
Актуальную версию документа, нынешнюю работу программы, марки тестов и долю охвата для этой статьи проверить не удалось. Имеющийся текст — официальный документ стандартов программы; за текущими подробностями следует обращаться к источникам министерства здравоохранения. Общую картину онкологического бремени страны см. в статье статистика рака в Турции на нашем сайте.
Молекулярная патология и возмещение расходов
В статье не делается никаких утверждений о возмещении SGK. Покрываются ли в Турции тесты оценки рецидива по экспрессии генов вроде Oncotype DX, сопутствующие PCR-диагностики или тесты ctDNA/MRD, для этой статьи проверить не удалось. К категорическим распространенным утверждениям следует относиться осторожно; актуальное положение уточняется у лечащего врача и соответствующей организации. Общий обзор доступа к новым препаратам и тестам рассмотрен в статье карта доступа в Турции к новым противораковым препаратам, одобренным FDA на нашем сайте.
Практическое замечание: тесты мутаций EGFR, KRAS, BRAF широко выполняются в Турции в университетских, учебно-исследовательских больницах и частных молекулярно-патологических лабораториях. Для пациента важно не только то, выполнен ли тест по факту, но и каким методом и с каким охватом он выполнен: заключение «мутация KRAS не обнаружена» нельзя полностью интерпретировать, не зная включенные в панель кодоны.
Хронология
Комментарий Академии DROZDOGAN
История PCR — один из самых ясных примеров распространения хорошей идеи в медицине. Но при обновлении статьи особенно поразило, что проверки требует не только сам метод, но и рассказы о нем по своей достоверности.
⚡ Почему это важно
Потому что PCR в онкологии уже не фоновая технология, а точка принятия решения. RT-PCR-результат по 21 гену позволяет тысячам женщин не получать химиотерапию. Измерение BCR-ABL1 определяет продолжение лечения пациента. Тест EGFR решает, какой препарат назначить. Для пациента это означает: фраза «результат теста не готов» равнозначна «мы не можем начать лечение». Знать, что такое PCR, — часть понимания собственного лечения.
✅ Сильная сторона
Причина сохранения PCR сорок лет — не изящество, а воспроизводимость. Одинаковый образец, праймеры, протокол — одинаковый результат в любой точке мира. Отчетность по Международной шкале для доли три на десять тысяч при хроническом миелоидном лейкозе — конкретное доказательство стандартизации: показатели лабораторий Анкары и Бостона сравнимы. В онкологии мало столь стандартизированных измерений.
⚠️ Слабая сторона
PCR находит только то, что вы ищете по своему принципу. Это самая обманчивая сторона отрицательных результатов: заключение «мутация не обнаружена» часто означает «мутации нашей панели не обнаружены», и это не одно и то же. Как в примере MGMT, две лаборатории с одним методом могут использовать разные пороги и дать одному пациенту разные результаты. Есть и контаминация: метод, размножающий одну молекулу, размножит и одну попавшую в воздух молекулу. Чувствительность PCR одновременно является ее уязвимостью.
🩺 Что сказать пациенту
(1) Объясните, что при назначении молекулярного теста результат может занять от нескольких дней до нескольких недель и это ожидание обычно необходимо для правильного выбора лечения. (2) Прочитайте отчет вместе: покажите, какие гены исследованы и каким методом. (3) Скажите, что «отрицательный» результат не абсолютен и зависит от охвата панели. (4) Заранее предупредите, что при недостатке ткани может понадобиться повторный тест или работа с кровью — это самая частая причина последующих задержек. (5) Напомните, что в интернете встретятся заявления «PCR-тесты ненадежны» и их источник обычно не связан с самим методом.
❓ Открытые вопросы
Опухоль-информированные MRD-тесты перешли к секвенированию; может ли цифровая PCR вернуться как более дешевая и быстрая альтернатива? Второе: если ctDNA положительна, но визуализация ничего не показывает, действительно ли раннее лечение продлевает выживаемость или мы лишь раньше узнаем о рецидиве? Это основной нерешенный вопрос MRD. Третье: почему оценки рецидива по экспрессии генов дают противоположные результаты в зависимости от менопаузы — действует сама химиотерапия или вызванная ею менопауза?
Вывод: Через сорок лет PCR сохраняет место, но уже не одна, а в разделении труда с секвенированием. С расширением применения в онкологии важнее самого метода становится то, как читают его отчет по результатам. При обновлении статьи больше всего усилий потребовало не добавление нового, а отсеивание неверной части старой информации : все восемь распространенных утверждений требовали поправки. Кажется, что знания не стареют, но наиболее повторяемые сведения устаревают быстрее всего.
Часто задаваемые вопросы
- Как быстро готов результат PCR-теста?
- Сама реакция обычно длится 1–3 часа. Но общее время клинического результата значительно больше: забор образца, доставка, выделение ДНК/RNA, реакция, интерпретация и отчет. В онкологии тканевые молекулярные тесты обычно занимают дни–недели. Это связано не с медлительностью метода, а со всем процессом.
- Что значит «мутация не обнаружена»?
- Это означает, что мутации исследованной панели не обнаружены, — не означает отсутствия любых мутаций. PCR видит только последовательности с разработанными праймерами. В отчете должны быть указаны исследованные участки генов; если их нет, следует спросить.
- Чем отличается PCR от секвенирования нового поколения?
- PCR находит искомое, секвенирование читает имеющееся. Для решения по одной известной мутации подходит PCR; для молекулярной карты опухоли — секвенирование. Это не конкуренты, а дополнения: FDA и сегодня одобряет PCR-тесты отдельных вариантов как сопутствующие диагностики.
- Низкий Ct означает тяжелую болезнь?
- Ct обратно пропорционален исходному количеству мишени: низкий Ct означает много мишени. Но Ct — относительное число и зависит от прибора, набора, техники забора. Значения Ct разных лабораторий напрямую несравнимы, и сам Ct не является мерой тяжести болезни.
- Диагностируют ли рак методом PCR?
- Нет. Рак диагностируют патологическим исследованием — оценкой ткани под микроскопом. PCR используют после диагноза, чтобы молекулярные характеристики опухоли определить, выбрать лечение и следить за ответом. Исключение — скрининг предраковых состояний, например HPV; и там окончательный диагноз тоже ставит патология.
- Можно ли обнаружить рак по крови?
- Циркулирующую опухолевую ДНК (ctDNA) обнаруживать возможно, и область быстро развивается. Но основное сегодняшнее применение — не скрининг , а выбор лечения и наблюдение рецидива уже диагностированного пациента. Значительная часть опухоль-информированных тестов наблюдения теперь основана не на PCR, а на секвенировании; некоторые не одобрены FDA, а работают как лабораторно разработанные тесты.
- Может ли PCR-тест ошибаться?
- Да. Главный источник ложноположительных результатов — контаминация: PCR размножает даже одну молекулу, поэтому попавший в воздух продукт создает проблему. Основные источники ложноотрицательных — ингибирование (кровь, формалин, гепарин), фрагментированная ДНК образца и отсутствие искомого варианта в панели. Поэтому хороший тест содержит внутренний контроль.
- Кто изобрел PCR — один человек?
- Идея принадлежит Kary Mullis, и Нобелевская премия по химии 1993 года присуждена ему за это. Но работы, сделавшие метод работоспособным, впервые применившие его к болезни и обеспечившие автоматизацию, — результат большой команды Cetus Corporation. У первой статьи 1985 года семь авторов, первый — Randall Saiki.
- Проводится ли в Турции скрининг HPV?
- Национальные стандарты определяют популяционный скрининг женщин 30–65 лет тестом HPV или Pap-мазком каждые пять лет. Образцы берет обученный персонал ASM или KETEM и отправляет в установленные центры. Актуальные подробности работы и охват программы для этой статьи проверить не удалось.
- Возмещаются ли эти тесты в Турции?
- Статья не утверждает ничего о возмещении: статус тестов экспрессии генов типа Oncotype DX, сопутствующих диагностик PCR и ctDNA-тестов в рамках SGK проверить не удалось. Актуальную информацию необходимо уточнять у лечащего врача и соответствующей организации.
Словарь
- Праймер
- Синтетический фрагмент ДНК обычно из 18–25 нуклеотидов, связывающийся с обоими концами целевой последовательности. Ограничивает размножаемый участок.
- Tm (температура плавления)
- Температура, при которой половина праймера отделяется от мишени. Отжиг устанавливают на 3–5 °C ниже.
- Денатурация
- Разделение двойной спирали ДНК нагреванием на две отдельные цепи.
- Taq-полимераза
- Thermus aquaticusтермостойкая ДНК-полимераза из этой бактерии. Оптимум 75–80 °C; корректирующей активности 3'→5' нет.
- Термоциклер
- Прибор, меняющий температуру пробирки PCR в запрограммированном порядке.
- RT-PCR
- PCR с обратной транскрипцией. RNA сначала превращают в cDNA, затем размножают.
- qPCR / PCR в реальном времени
- PCR с наблюдением размножения по флуоресценции каждого цикла. Дает количественный результат.
- Ct / Cq
- Номер цикла пересечения порога флуоресценции. Низкое значение означает много исходной мишени.
- Зонд TaqMan
- Зонд со светящейся молекулой на одном конце и гасителем на другом. При расщеплении полимеразой освобождается свет.
- Цифровая PCR (dPCR/ddPCR)
- Метод разделения образца на тысячи отсеков с подсчетом положительных. Абсолютный подсчет без стандартной кривой.
- Сопутствующий диагностический тест
- Одобренный тест, названный в инструкции препарата и определяющий, кому его назначать.
- ctDNA
- Циркулирующая опухолевая ДНК. Ее доля во всей свободной ДНК часто очень мала.
- Минимальная остаточная болезнь (MRD)
- Микроскопическая болезнь после лечения, невидимая визуализацией, но определяемая молекулярными методами.
- Международная шкала (IS)
- Стандартизированная шкала отчетности для сравнения измерений BCR-ABL1 между лабораториями.
- Метилирование-специфическая PCR (MSP)
- PCR с праймерами, различающими метилированную и неметилированную ДНК.
- Контаминация
- Попадание в образец ДНК предыдущих реакций или среды. Основная причина ложноположительной PCR.
Примечание о прозрачности.
Подтверждено: 1985 Science полный список авторов статьи, том и страницы; статья Mullis и Faloona 1987 года Methods in Enzymology в этом издании; лауреаты и обоснование Нобелевской премии по физиологии или медицине 1968 года; синтез гена Khorana в 1972 году; открытие Kornberg в 1956 году и Нобелевская премия 1959 года; Thermus aquaticusобнаружение Brock и Freeze в Йеллоустоуне в 1969 году; очистка Taq-полимеразы Chien, Edgar и Trela в 1976 году и ее оптимальная температура; период полураспада Taq при 95 °C и частота ошибок; собственное описание Mullis отказа Science в Нобелевской лекции; 1988 Science статья о Taq; «Mr. Cycle» и TC1 DNA Thermal Cycler; разделение Нобелевской премии по химии 1993 года и основания; взгляды Mullis на HIV-AIDS, климат и астрологию, дата смерти и возраст; исследование Higuchi 1992 года; введение термина цифровая PCR Vogelstein и Kinzler в 1999 году и заявленная чувствительность; знак CE 2017 года и одобрение FDA 2019 года клинической ddPCR; структура Oncotype DX из 21 гена / 16+5 и метод RT-PCR (страница производителя); результаты TAILORx и RxPONDER (сообщения NCI и SWOG); определения молекулярного ответа BCR-ABL1; одобрение FDA самостоятельного забора для HPV от 14 мая 2024 года; тест Aptima на E6/E7 mRNA; рекомендации скрининга ACS 2020 года; данные метаанализа MGMT; соответствия производителя, PMA и препарата в списке FDA сопутствующих диагностик; метод и регуляторный статус Signatera по производителю; текст турецких стандартов скрининга шейки матки.
Не подтверждено: Первичный источник годов расшифровки генетического кода (1961, 1966); соавторы Kornberg в работе 1956 года и явное подтверждение исходного организма; имена инженеров «Mr. Cycle»; разработчики химии TaqMan и дата первого коммерческого прибора реального времени; учреждение Higuchi в 1992 году; разработчик и год LAMP (поэтому LAMP не включена); мировое общее число тестов пандемии; общее число одобренных FDA PCR-тестов; годы одобрения сопутствующих диагностик (поэтому не приведены); нужная глубина и продолжительность ответа для отмены лечения при хроническом миелоидном лейкозе; первичное подтверждение, что cobas HPV — PCR реального времени; авторитетные числовые сравнения времени, стоимости и чувствительности PCR и секвенирования; выживаемость глиобластомы по MGMT; нынешняя работа, марки тестов и охват скрининга шейки матки в Турции; статус возмещения SGK (никаких утверждений не делалось).
Характер поправок: Таблица восьми поправок возникла из сравнения утверждений прежней версии статьи и распространенных турецких источников с первичными и вторичными источниками. Вывод о неподтвержденности «отказа 15 журналов» принадлежит нам: надежного источника утверждения не найдено, но документированы два отказа (Nature и Science). Оценка необходимости отделять научный метод Mullis от личных взглядов также принадлежит этой статье.
Заявление об интересах: Мы не связаны ни с одним названным тестом, прибором или производителем.
Источники
- Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. «Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.» Science 1985;230(4732):1350–1354.
- Mullis KB, Faloona FA. «Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.» Methods in Enzymology 1987;155:335–350.
- Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. «Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.» Science 1988;239(4839):487–491.
- Chien A, Edgar DB, Trela JM. «Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus." Journal of Bacteriology 1976;127(3):1550–1557.
- Нобелевская премия по химии 1993 — Kary B. Mullis и Michael Smith. nobelprize.org
- Mullis KB. Нобелевская лекция, 8 декабря 1993. nobelprize.org
- Нобелевская премия по физиологии или медицине 1968 — Holley, Khorana, Nirenberg. nobelprize.org
- Нобелевская премия по физиологии или медицине 1959 — Ochoa, Kornberg. nobelprize.org
- Higuchi R, и др. «Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.» Bio/Technology 1992.
- Vogelstein B, Kinzler KW. Определение концепции цифровой PCR, 1999.
- National Cancer Institute. «TAILORx trial: chemotherapy not beneficial for many women with early breast cancer.» Пресс-релиз, 2018. cancer.gov
- SWOG Cancer Research Network. Сообщение о публикации результатов RxPONDER в NEJM, 3 декабря 2021. swog.org
- Exact Sciences. Oncotype DX Breast Recurrence Score — страница для медицинских специалистов. exactsciences.com
- U.S. Food and Drug Administration. «List of Cleared or Approved Companion Diagnostic Devices (In Vitro and Imaging Tools).» fda.gov
- National Cancer Institute. «FDA approves self-collection for HPV tests.» Cancer Currents Blog, 2024. cancer.gov
- American Cancer Society. Руководство по скринингу рака шейки матки, 2020. pressroom.cancer.org
- Hologic. Информация о тесте Aptima HPV — E6/E7 mRNA. hologic.com
- Сравнительный метаанализ методов определения метилирования промотора MGMT. Neuro-Oncology 2021;23(9):1457.
- Natera. Signatera — информационная страница для клиницистов. natera.com
- National Cancer Institute. «Biomarker Testing for Cancer Treatment.» cancer.gov
- Министерство здравоохранения Турецкой Республики. Национальные стандарты программы скрининга рака шейки матки.
- Brock TD, Freeze H. Thermus aquaticusвыделение этой бактерии, 1969.
Эта статья была полезна?
Ваш отзыв помогает нам улучшать материалы.
Комментарии читателей
Оставьте комментарий
Ваше имя и комментарий публикуются только после одобрения администратором. Ваш адрес электронной почты никогда не показывается посетителям.
Будьте первым, кто оставит комментарий.