Ce este reacția de polimerizare în lanț? Istoria PCR, cum se efectuează și importanța medicală
În acest articol
Reacția de polimerizare în lanț (PCR) este metoda care permite copierea de milioane de ori a unui fragment de ADN în laborator. Ideea apărută în timpul unei călătorii nocturne în 1983 a devenit, în patruzeci de ani, baza diagnosticului genetic, a alegerii tratamentului oncologic, a medicinei legale și a infrastructurii de testare într-o pandemie globală. Articolul explică PCR de la început și corectează, cu surse, câteva informații greșite răspândite despre subiect.
Cel mai simplu mod de a înțelege PCR este această analogie: aveți o singură pagină, prea ștearsă pentru a fi citită. PCR o face lizibilă fotocopiind-o de miliarde de ori. Există însă o diferență importantă: copiatorul reproduce întreaga pagină, pe când PCR multiplică numai paragraful pe care l-ați marcat . Marcarea este făcută de fragmente sintetice scurte de ADN numite primeri . Această selectivitate este ceea ce transformă metoda dintr-un instrument de copiere într-un instrument de diagnostic .
În oncologie, PCR nu este o tehnică abstractă de laborator. Testul cu 21 de gene care stabilește necesitatea chimioterapiei în cancerul de sân este un test RT-PCR. În leucemia mieloidă cronică, răspunsul pacientului la tratament se măsoară prin PCR. Testul HPV pentru screeningul cancerului de col uterin se bazează pe PCR. Testul EGFR care stabilește medicamentul țintit în cancerul pulmonar este PCR. Așadar, PCR nu este „tehnologia din fundal” în oncologie, ci însăși decizia terapeutică.
Ce este PCR, într-o singură propoziție? Multiplicarea exponențială a unei secvențe de ADN delimitate la ambele capete prin primeri sintetici, prin cicluri de încălzire–răcire și cu o enzimă ADN-polimerază termorezistentă. Numărul copiilor se dublează teoretic la fiecare ciclu; după 30 de cicluri, dintr-o singură moleculă se obține aproximativ un miliard de copii.
Cum funcționează PCR? Trei etape
PCR constă integral în modificarea temperaturii într-o anumită ordine. Într-un tub se află ADN-ul țintă, doi primeri, enzima ADN-polimerază, patru nucleotide (A, T, G, C) și o soluție tampon adecvată. Aparatul, termociclorul , modifică automat temperatura acestui tub.
| Etapă | Temperatură | Durată | Ce se întâmplă? |
|---|---|---|---|
| 1. Denaturare | 94–98 °C | 20–30 de secunde | Legăturile de hidrogen care mențin dublul helix se rup; cele două catene se separă. |
| 2. Legarea primerilor (annealing) |
50–65 °C | 20–40 de secunde | Primerii sintetici se fixează la cele două capete ale regiunii țintă și delimitează zona de multiplicat. |
| 3. Elongare (extension) |
72 °C | Variază după lungime | ADN-polimeraza sintetizează noua catenă începând de la capătul primerului. |
Aceste trei etape se repetă de 25–40 de ori. Numărul copiilor se dublează teoretic la fiecare ciclu.
O corecție: temperatura de legare nu este „37–65 °C”. Pe internet și în multe surse turcești, temperatura de legare a primerilor este prezentată ca un interval începând de la 37 °C. Această informație aparține primilor ani ai PCR, perioadei 1983–1985 când se folosea enzima Klenow, sensibilă la căldură . În PCR modernă, temperatura de legare este stabilită cu aproximativ 3–5 °C sub temperatura de topire a primerilor (Tm) ; deoarece primerii tipici de 18–25 de nucleotide au Tm de 55–65 °C, intervalul practic este 50–65 °C. Lucrul la 37 °C face ca primerii să se fixeze în locuri greșite, producând produse nespecifice. Diferența nu este academică: într-un test diagnostic înseamnă un rezultat fals pozitiv.
De ce este obligatorie o enzimă termorezistentă?
Forma inițială a PCR avea o problemă practică importantă. La fiecare ciclu, tubul era adus la 94 °C pentru separarea ADN-ului; temperatura separa ADN-ul, dar inactiva și enzima. De aceea, la începutul fiecărui ciclu trebuia deschis tubul și adăugată manual enzimă nouă. Un experiment cu 30 de cicluri însemna 30 de adăugări manuale de enzimă; automatizarea era imposibilă.
Soluția a venit de la o bacterie care trăiește în izvoare termale. Thermus aquaticus are o ADN-polimerază, numită pe scurt Taq-polimerază , care funcționează optim la 75–80 °C și chiar la 95 °C are un timp de înjumătățire de aproximativ 40 de minute. Introducerea Taq în PCR a eliminat necesitatea deschiderii tubului; procesul a devenit complet automat. Acesta este pasul care a transformat PCR dintr-un truc de laborator într-un standard industrial .
Taq are un punct slab: Nu are activitate de corectare 3'→5' (proofreading), deci nu poate reveni asupra unei erori de copiere pentru a o corecta. Rata erorilor raportată pentru enzima originală este aproximativ una la 9.000 de nucleotide. Aceasta nu reprezintă o problemă pentru majoritatea aplicațiilor diagnostice, dar în secvențiere sau clonare, unde o singură literă contează, se preferă alte polimeraze termorezistente cu activitate de corectare, precum Pfu sau Phusion. A spune „a fost efectuat PCR” nu înseamnă că a fost aplicată o singură metodă cu o singură enzimă.
Istoria PCR și cele opt informații greșite în circulație
Povestea PCR este relatată în mare parte corect în sursele turcești, dar câteva date și un mit sunt repetate constant. Tabelul următor prezintă alăturat afirmațiile răspândite pe internet, existente și în versiunea anterioară a acestui articol, și variantele lor verificate.
| Afirmația în circulație | Varianta corectă |
|---|---|
| „A fost prezentată în 1985 de Erlich, Mullis și Saiki” | Articolul are șapte autori, iar primul autor este Saiki: Saiki, Scharf, Faloona, Mullis, Horn, Erlich, Arnheim. Science 1985;230(4732):1350–1354. |
| „În 1966, Nirenberg, Khorana și Holley au descifrat codul genetic și au sintetizat o genă artificială; Khorana a primit Nobelul pentru aceasta” | Premiul Nobel a fost acordat în 1968, iar motivul a fost „interpretarea codului genetic și a funcției sale în sinteza proteinelor”, nu gena artificială. Prima sinteză completă a unei gene de către Khorana datează din 1972, față de Nobel, cu patru ani mai târziu. |
| „Taq-polimeraza descoperită în 1976 a fost obținută din Thermus aquaticus” | Au fost combinate două evenimente distincte. Bacteria, în 1969, a fost descoperită la Yellowstone de Thomas Brock și Hudson Freeze. Enzima, în 1976, a fost purificată de Chien, Edgar și Trela (J Bacteriol 1976;127:1550–1557). |
| „Enzimă rezistentă la 94 °C” | Corect, dar incomplet: pentru Taq, temperatura optimă de lucru este 75–80 °C; la 95 °C timpul de înjumătățire este de aproximativ 40 de minute, iar la 92,5 °C depășește 2 ore. |
| „Articolul a fost respins de aproximativ 15 reviste” | Nesusținut de dovezi. Există două respingeri documentate: Nature și Science. În prelegerea Nobel, Mullis însuși relatează Science și respingerea acesteia. Articolul metodologic a fost publicat în 1987 în Methods in Enzymology. Nu a fost găsită o sursă sigură pentru „15 reviste”. |
| „În 1986, Taq-polimeraza a fost adăugată în PCR” | Articolul care descrie PCR cu Taq este din 1988 : Saiki și colaboratorii, Science 1988;239(4839):487–491. |
| „Un an mai târziu, Perkin Elmer a dezvoltat termociclorul” | Ordinea a fost inversată. Aparatul prototip al Cetus, „Mr. Cycle”, în 1985–86,a fost realizat; primul aparat comercial al Perkin-Elmer Cetus era TC1 DNA Thermal Cycler, din 1987. Așadar, aparatul a venit înainte de articolul Taq. |
| „Legarea primerilor la 37–65 °C” | În PCR modernă, 50–65 °C; cu 3–5 °C sub Tm al primerului. Temperatura de 37 °C aparține perioadei 1983–85, când se lucra cu enzima Klenow. |
Dintre aceste corecții, cea mai instructivă este a cincea. Povestea „15 reviste au respins articolul geniului” este un tipar foarte îndrăgit în comunicarea științei: sistemul este orb, individul are dreptate. Povestea reală este mai interesantă și mai realistă: două reviste mari au respins articolul, metoda a apărut într-o revistă de metodologie, iar articolul de aplicație din 1985, care a produs adevărata descoperire, fusese deja publicat în Science. Așadar, sistemul nu era orb; ideea în sine nu fusese considerată convingătoare până la demonstrarea utilității sale. Aceasta explică mult mai corect funcționarea științei decât mitul celor „15 respingeri”.
Noaptea în care a apărut ideea
Potrivit relatării lui Mullis, ideea i-a venit într-o vineri noapte din primăvara lui 1983, în drum de la Berkeley spre cabana sa din nordul Californiei, pe șoseaua cu numărul 128 . A oprit mașina, a scos hârtie din torpedou și a scris. În biografia Nobel descrie momentul drept „când castanii californieni erau în floare”. Prima demonstrație reușită a metodei este consemnată la 16 decembrie 1983 .
Esența ideii este de fapt simplă și tocmai de aceea nimănui nu îi venise în minte: ADN-polimeraza era deja cunoscută (1956), primerii puteau fi deja sintetizați și se știa deja că ADN-ul se separă prin încălzire. Mullis nu a descoperit o moleculă nouă, ci a reunit trei lucruri cunoscute într-un ciclu. De aici a apărut multiplicarea exponențială.
Prima aplicație publicată a fost un test diagnostic. Articolul din 1985 apărut în Science nu privea biologia fundamentală, ci diagnosticul anemiei falciforme: multiplicarea genei β-globinei și examinarea ei prin analiză de restricție. PCR a fost prezentată lumii direct ca instrument de diagnostic clinic , nu ca instrument de cercetare. Privind locul său în oncologie patruzeci de ani mai târziu, acest început pare semnificativ.
Kary Mullis: separarea metodei de om
Mullis a împărțit Premiul Nobel pentru Chimie din 1993 cu Michael Smith ; Smith a primit premiul pentru mutageneză dirijată (site-directed mutagenesis). Motivația pentru Mullis era o singură propoziție: „pentru inventarea metodei reacției de polimerizare în lanț”.
Anii ulteriori ai lui Mullis reprezintă însă unul dintre exemplele incomode din istoria științei. Este documentat că a negat faptul că HIV provoacă SIDA , deși nu avea experiență de cercetare în niciunul dintre cele două domenii. A minimalizat schimbările climatice antropice și subțierea ozonului, susținând că oamenii de știință colaborează pentru finanțare. A declarat că crede în astrologie și a relatat în autobiografie întâlnirea cu un raton luminos care vorbea , despre care considera că ar putea fi o ființă extraterestră. A murit la 7 august 2019, la vârsta de 74 de ani, din cauza complicațiilor pneumoniei.
Este necesar să scriem aceasta deoarece raționamentul opus este foarte răspândit. Afirmația „omul care a descoperit PCR nega legătura HIV–SIDA” a fost folosită repetat în pandemie pentru discreditarea testelor PCR. Raționamentul este greșit în ambele sensuri: Premiul Nobel nu face ca o persoană să aibă dreptate în orice; nici greșelile acelei persoane în alte domenii nu demonstrează că metoda sa este invalidă. PCR este validă independent de opiniile lui Mullis, deoarece a oferit rezultate reproductibile în milioane de experimente timp de patruzeci de ani. O metodă rezistă prin reproductibilitate , nu prin autoritatea inventatorului. Această distincție este un filtru valabil și pentru afirmațiile de tipul „acel savant celebru a spus...” întâlnite de pacienții cu cancer.
PCR nu este o singură metodă: patru generații
PCR din anii 1980 nu este același lucru cu PCR folosită astăzi într-un laborator oncologic. Metoda a evoluat în patru generații, fiecare apărând pentru a răspunde unei întrebări la care precedenta nu putea răspunde.
| Generație | An | Întrebarea la care răspunde | Mod de măsurare |
|---|---|---|---|
| PCR clasică (la punct final) | 1983–85 | „Această secvență există sau nu?” | La sfârșitul ciclurilor se verifică existența unei benzi pe gel: calitativ |
| RT-PCR (transcripție inversă) |
Sfârșitul anilor 1980 | „Acest ARN există? Cât este exprimată această genă?” | ARN-ul este transformat mai întâi în ADNc, apoi multiplicat |
| PCR în timp real (qPCR) | 1992 | „Cât există?” | Fluorescența este măsurată la fiecare ciclu: cantitativ relativ |
| PCR digitală (dPCR/ddPCR) | 1999 (concept) | „Câte molecule există? Și poți găsi, între 100.000 de molecule normale, 1 moleculă mutantă?” | Proba este împărțită în mii de picături și se numără cele pozitive: cantitativ absolut |
PCR în timp real (qPCR) și valoarea Ct
Problema PCR clasice era următoarea: analiza se făcea după terminarea reacției, când materialele din tub erau epuizate și multiplicarea ajunsese la platou. O probă pornită cu 10 copii și una cu 10.000 ofereau la sfârșit benzi similare. Așadar, putea fi răspunsă întrebarea „există?” , dar nu întrebarea „cât există?” .
Studiul publicat în 1992 de Higuchi și colaboratorii a schimbat aceasta: multiplicarea nu este urmărită după încheiere, ci în timp ce se produce . În tub se introduce un sistem fluorescent, iar aparatul măsoară lumina la fiecare ciclu. În chimia folosită frecvent, TaqMan , există o sondă care se leagă de țintă; la un capăt se află o moleculă emițătoare de lumină, la celălalt un agent care o suprimă, quencher. În timpul elongării, Taq-polimeraza întâlnește sonda și o fragmentează; capetele se separă și lumina este eliberată. Creșterea luminii este proporțională cu multiplicarea.
Ce este Ct (sau Cq)? Este numărul ciclului la care semnalul fluorescent depășește pragul (threshold cycle / quantification cycle; ghidul MIQE preferă termenul „Cq”). Logica este inversă și frecvent confundată: Cu cât Ct este mai mic, cu atât cantitatea inițială de țintă este mai mare. O reacție care pornește cu multe copii depășește pragul devreme. De aici provin discuțiile pandemice „Ct-ul meu este 32, am puțin virus?”; majoritatea omiteau faptul că Ct este un număr relativ, variabil în funcție de aparat și protocol .
PCR digitală: măsurare prin numărare
qPCR măsoară relativ, indicând „de atâtea ori mai mult” față de o referință. PCR digitală aplică altă logică: împarte proba în mii de compartimente mici, picături, astfel încât fiecare să primească fie o moleculă țintă, fie niciuna. După cicluri, compartimentele pozitive sunt numărate. Numărul inițial de molecule este calculat direct prin statistica Poisson, fără necesitatea unei curbe standard.
Conceptul, în 1999, a fost denumit de Bert Vogelstein și Kenneth Kinzler , iar prima aplicație demonstrată privea exact subiectul acestui articol: detectarea mutațiilor canceroase rare. Au existat și precursori: cercetătorii Cetus demonstraseră în 1988 detectarea unei singure copii β-globină prin diluție, iar Morley și Sykes transformaseră în 1992 diluția limitantă într-o tehnică de cuantificare.
Importanța PCR digitale în oncologie provine dintr-o singură caracteristică: poate găsi ceea ce este rar. Performanța raportată este următoarea: ADN-ul mutant poate fi detectat în ADN normal de 200.000 de ori mai abundent ; față de qPCR clasică, este raportată o sensibilitate de aproximativ 2.000 de ori mai mare; o secvență la 1.250.000 de celule poate fi detectată. Deoarece proporția ADN-ului tumoral circulant (ctDNA) în totalul ADN-ului liber este adesea sub o miime, acest nivel de sensibilitate nu este un lux, ci o condiție prealabilă. Primul sistem PCR digitală în picături aprobat pentru utilizare clinică a primit marcajul CE în 2017 și, în 2019, aprobarea FDA pentru leucemia mieloidă cronică .
RT-PCR și pandemia
ARN-ul nu poate fi multiplicat direct; mai întâi trebuie transformat în ADN (ADNc) prin enzima revers-transcriptază. Metoda cu această etapă adăugată se numește RT-PCR . Deoarece SARS-CoV-2 este un virus ARN, testul său a fost construit pe aceeași logică: mai întâi transcripție inversă, apoi multiplicare în timp real, adică RT-qPCR. Posibilitatea detectării și cuantificării într-o singură analiză închisă l-a transformat în testul de referință.
Lecția cea mai durabilă a pandemiei pentru PCR privește limita metodei, nu puterea ei. PCR găsește secvența țintă, dar nu spune dacă aceasta aparține unui organism viu și contagios . De aceea, fragmentele de ARN viral detectabile săptămâni după dispariția infecției puteau produce rezultate pozitive. Aceeași limită există și în oncologie și este mai puțin discutată: PCR arată prezența unei mutații, nu dacă celula care o poartă determină creșterea tumorii. Folosirea corectă a metodei cere să știm atât ce spune, cât și ce nu spune . Pentru acest articol nu a putut fi verificată o cifră sigură a numărului total de teste efectuate în lume în timpul pandemiei; de aceea nu este oferit un număr.
PCR în oncologie: patru exemple concrete
Locul PCR în medicina oncologică depășește mult formularea „este folosită în cercetare”. Următoarele patru exemple reprezintă situații în care rezultatul PCR devine direct decizie terapeutică .
1. Decizia chimioterapiei în cancerul de sân: Oncotype DX
În cancerul de sân precoce cu receptori hormonali pozitivi și HER2 negativ, una dintre cele mai dificile întrebări este dacă pacienta trebuie să primească chimioterapie postoperatorie. Testul Oncotype DX Breast Recurrence Score caută răspunsul examinând expresia genelor din țesutul tumoral. Conform producătorului, testul evaluează expresia a 21 de gene , și anume 16 gene asociate cancerului și 5 gene de referință , folosind pentru aceasta „reacția de polimerizare în lanț cu transcripție inversă (RT-PCR) pentru analiza ARN-ului tumoral” . Proba este țesut prelevat prin biopsie cu ac tăietor sau excizie chirurgicală.
| Studiu | Pacienți | Populație | Rezultat |
|---|---|---|---|
| TAILORx | 10.273 | Ganglioni negativi; au fost randomizate persoanele cu scor 11–25 | Supraviețuire fără boală invazivă la 9 ani %83,3 (numai tratament endocrin) — %84,3 (endocrin + chimioterapie); supraviețuirea globală %93,9 – %93,8. Așadar, chimioterapia nu aduce beneficii. Excepție: la vârsta de 50 de ani sau mai puțin, în grupa cu scor 16–25 a fost observat un mic beneficiu. |
| RxPONDER | 5.083 | 1–3 ganglioni pozitivi, scor ≤25 | Supraviețuire fără boală invazivă la 5 ani — postmenopauză: %91,9 față de %91,3 (fără diferență); premenopauză: %89,0 față de %93,9 (în favoarea chimioterapiei). |
Surse: comunicatul NCI (TAILORx) și anunțul SWOG (RxPONDER).
Vestea principală aici nu este cui îi indică testul chimioterapia, ci cui nu i-o indică. Rezultatul TAILORx a permis ca zeci de mii de femei cu ganglioni negativi și scor intermediar să evite chimioterapia și reacțiile sale adverse permanente, datorită unui test RT-PCR. RxPONDER a arătat că rezultatul se inversează după statutul menopauzal, demonstrând că un singur număr nu înseamnă același lucru la fiecare pacientă. Detaliile clinice ale acestei decizii au fost abordate în articolul pacientele care nu vor primi chimioterapie după operația cancerului de sân , iar comparația diferitelor teste genomice în articolul testele genomice ale scorului de recidivă în cancerul de sân lobular , unde au fost analizate.
2. Măsurarea răspunsului în leucemia mieloidă cronică: BCR-ABL1
Leucemia mieloidă cronică este boala în care PCR este cel mai profund integrată în oncologie. Transcriptul de fuziune care conduce boala, BCR-ABL1 , este măsurat prin RT-PCR cantitativă, iar rezultatul este raportat pe Scala internațională (International Scale, IS) . Succesul terapeutic nu este definit aici prin „s-a micșorat tumora?”, ci prin numărul de logaritmi cu care a scăzut o valoare numerică .
| Nivel | Definiție | Semnificație |
|---|---|---|
| %1 IS | BCR-ABL1 ≤ %1 | Echivalentul răspunsului citogenetic complet |
| MMR / MR3 | BCR-ABL1 ≤ %0,1 | Față de valoarea inițială, 3 log reducere — răspuns molecular major |
| MR4 | ≤ %0,01 sau nedetectabil cu >10.000 de transcripte ABL1 | Reducere de 4 log |
| MR4.5 | ≤ %0,0032 sau nedetectabil cu >32.000 de transcripte ABL1 | Reducere de 4,5 log |
| MR5 | ≤ %0,001, cu >100.000 de transcripte ABL1 | Reducere de 5 log |
Reperele răspunsului sunt evaluate de obicei la 3., 6. și 12. luni . Numerele de transcripte din definiții sunt condiția de sensibilitate a testului: pentru raportarea MR4.5, laboratorul trebuie să fi multiplicat cel puțin 32.000 de transcripte de control.
Acest tabel este cea mai impresionantă ilustrare a sensibilității atinse de PCR. Măsurarea sigură a unei proporții de trei la zece mii înseamnă numărarea câtorva molecule la un milion; această măsurare se face la fiecare trei luni într-un laborator spitalicesc obișnuit. Răspunsul molecular profund și menținut permite discutarea încercării de întrerupere a inhibitorului tirozin-kinazei, adică remisia fără tratament, la unii pacienți. Totuși, profunzimea și durata răspunsului necesare încercării de întrerupere nu au putut fi verificate pentru acest articol; decizia aparține hematologului și aici nu este oferit un prag numeric.
3. Testul HPV în screeningul cancerului de col uterin
În ultimii douăzeci de ani, screeningul cancerului de col uterin a trecut de la examinarea celulei, citologie/frotiu, la examinarea acidului nucleic al virusului . Ghidul din 2020 al Societății Americane de Cancer spune explicit: „De la 25 la 65 de ani, testul HPV primar efectuat la fiecare cinci ani, adică fără test Pap, să fie metoda preferată” ; testarea combinată și citologia singură rămân „alternative acceptabile”, deoarece accesul la un test HPV aprobat pentru screening primar poate să nu fie posibil pretutindeni.
Trebuie făcută o distincție în acest domeniu: nu toate testele HPV sunt PCR. Testul Aptima HPV nu detectează ADN-ul viral, ci ARNm E6/E7 și folosește o chimie de multiplicare diferită. Distincția este importantă: detectarea ARNm pretinde să arate nu numai prezența virusului, ci faptul că oncogenele sale sunt active .
Noutate: autoprelevarea probei. FDA a aprobat, la 14 mai 2024 , pentru două teste HPV, BD Onclarity HPV și Roche cobas HPV , prelevarea probei de către femeie însăși. Aprobarea acoperă prelevarea probei „într-un mediu medical precum cabinete de asistență primară, centre de îngrijire urgentă, farmacii și clinici mobile” . Acesta este un reper important pentru femeile care nu participă deloc la screening de teama examenului ginecologic. Prevenirea cancerului de col uterin prin screening a fost discutată în articolul nostru despre cancerul cervical , în detaliu.
4. Predicția răspunsului terapeutic în glioblastom: metilarea MGMT
În glioblastom, metilarea sau absența metilării promotorului genei MGMT prezice probabilitatea beneficiului chimioterapiei cu temozolomidă. Principala metodă de identificare este PCR specifică metilării (methylation-specific PCR, MSP), iar a doua este pirosecvențierea (pyrosequencing, PSQ).
Neuro-Oncology a publicat metaanaliza bazată pe Cochrane care arată numeric predominanța metodei: în aproximativ 190 de studii cu o singură tehnică, însumând 27.710 participanți, 94 de studii au folosit MSP și 27 pirosecvențiere . Comparând puterea predictivă la pacienții cu glioblastom tratați cu temozolomidă, față de imunohistochimie, raportul rapoartelor de hazard (RHR) al MSP a fost 1,31 (%95 IC 1,01–1,71), iar cel al pirosecvențierii 1,36 (1,01–1,84) ; diferența dintre pirosecvențiere și MSP nu a fost semnificativă (1,14; 0,87–1,48). Referitor la prag, pentru regiunile CpG 74–78 s-a raportat că pragul de %9 a funcționat mai bine decât pragurile mai ridicate de %28–29.
Această ultimă propoziție arată un aspect puțin discutat al testelor moleculare: examinând aceeași probă prin aceeași metodă, dar folosind praguri diferite , două laboratoare pot da rezultate diferite aceluiași pacient. „MGMT metilat” este o afirmație incompletă fără cunoașterea metodei și pragului. Modul în care diagnosticul molecular stabilește tratamentul în glioblastom a fost abordat în articolele diagnosticul molecular al glioblastomului și gliomul de grad înalt cu IDH de tip sălbatic .
Teste diagnostice companion bazate pe PCR (companion diagnostics)
Lista oficială FDA a testelor diagnostice companion include numeroase teste PCR menționate în eticheta unui medicament, care stabilesc cine îl va primi. Cele de mai jos sunt preluate direct din listă.
| Test | Producător | Număr PMA | Medicamentul/medicamentele asociate |
|---|---|---|---|
| cobas EGFR Mutation Test v2 | Roche Molecular Systems | P120019 | Osimertinib, erlotinib, gefitinib, afatinib |
| therascreen KRAS RGQ PCR Kit | QIAGEN | P140022 | Cetuximab, panitumumab |
| cobas KRAS Mutation Test | Roche Molecular Systems | P140023 | Cetuximab, panitumumab |
| therascreen PIK3CA RGQ PCR Kit | QIAGEN | P180001 | Alpelisib |
| cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test | Roche Molecular Systems | P110020 | Vemurafenib; ulterior cobimetinib |
| therascreen BRAF | QIAGEN | P130010 | Vemurafenib |
Producătorii, numerele PMA și medicamentele asociate provin din lista FDA a testelor diagnostice companion. Anii aprobării nu au fost incluși în tabel, deoarece nu au putut fi verificați individual pentru acest articol ; data fiecărui test poate fi verificată prin numărul PMA pe accessdata.fda.gov.
Tabelul rezumă dintr-o privire rolul PCR în oncologie: în cancerul pulmonar , cine primește inhibitor EGFR, în cancerul colorectal , cine nu primește anticorp anti-EGFR, iar în melanom, cine este eligibil pentru inhibitor BRAF: toate depind de un rezultat PCR. Tipul carcinomului stabilit prin raportul anatomopatologic nu mai este suficient singur; îl însoțește raportul molecular.
Biopsia lichidă și boala reziduală minimă: se încheie epoca PCR?
Determinarea persistenței bolii microscopice după operație prin măsurarea ADN-ului tumoral circulant (ctDNA), adică urmărirea bolii reziduale minime (MRD), este unul dintre domeniile oncologice cu cea mai rapidă creștere. Considerând sensibilitatea PCR digitale pentru variante rare, ar fi fost de așteptat dominația ei naturală în acest domeniu. Realitatea este mai complicată.
Trebuie corectată o eroare frecventă. Signatera, unul dintre testele MRD ghidate de tumoră folosite frecvent, este descris adesea ca „PCR multiplex personalizată”. Pagina actuală pentru medici a producătorului îl descrie însă astfel: prin analiza țesutului tumoral folosind secvențierea întregului exom sau întregului genom se construiește un panel personalizat, sunt selectate 64 de variante clonale , care sunt apoi căutate în sânge prin „secvențiere ultraprofundă la o adâncime de până la 350.000 de ori pentru fiecare variantă selectată” . Așadar, etapa de citire este secvențierea, nu PCR. Aceeași pagină precizează explicit că testul nu este aprobat de FDA („have not been cleared or approved by the US Food and Drug Administration”); laboratorul funcționează cu acreditări CLIA și CAP, iar testul este acoperit de Medicare pentru monitorizarea progresiei, recurenței și recăderii bolii.
Concluzia nu este că PCR regresează, ci că se schimbă împărțirea sarcinilor. Când mutațiile tumorii sunt necunoscute , este necesară secvențierea, deoarece PCR găsește numai ceea ce căutați. Dar când mutația căutată este cunoscută , PCR este mai rapidă, mai ieftină și adesea suficient de sensibilă. Implicațiile clinice ale schimbării tratamentului ghidate de ctDNA au fost abordate în articolele studiul GALAXY și SERENA-6: schimbarea tratamentului în funcție de mutația ESR1 ; screeningul prin analize de sânge a fost abordat în articolul screeningul cancerului de colon bazat pe fragmentomică și metilare .
PCR sau secvențiere de nouă generație?
Întrebarea este frecventă și de obicei formulată greșit. Cele două nu sunt rivale, ci instrumente pentru întrebări diferite. Potrivit Institutului Național de Cancer, unele teste de biomarkeri „examinează un singur biomarker”, altele „examinează simultan mulți biomarkeri și pot fi numite teste multigenice sau de panel”, iar altele citesc întregul exom ori genom.
| Test bazat pe PCR | Secvențiere de nouă generație (NGS) | |
|---|---|---|
| Logica de bază | Găsește ceea ce caută | Citește ceea ce există |
| Țintă | Număr limitat de variante definite în prealabil | Panel larg, exom sau genom |
| Variantă necunoscută | Nu o poate vedea: nu a fost proiectat un primer | O poate vedea |
| Statut de reglementare | Poate fi test diagnostic companion menționat în eticheta medicamentului | Există și aprobări pentru paneluri largi |
| Utilizare tipică | Luarea unei singure decizii | Realizarea hărții |
Notă: În acest tabel nu au fost oferite intenționat comparații de durată, cost sau sensibilitate. La pregătirea articolului nu a putut fi verificată o sursă autoritară pentru cifrele răspândite pe aceste subiecte; în locul estimării, au fost omise.
Argumentul structural este următorul: FDA continuă și astăzi să aprobe teste PCR pentru o singură variantă drept teste diagnostice companion, menționate în etichetele medicamentelor. Dacă secvențierea ar fi înlocuit complet PCR, rândurile PCR ale listei ar fi dispărut. Nu dispar. Secvențiere pentru harta mutațiilor, PCR pentru o decizie bazată pe o mutație cunoscută: cele două lucrează împreună. Importanța locului mutației în genă este demonstrată și de studii care sunt tocmai produsul acestei abordări pe două niveluri.
Limitele PCR și sursele de eroare
Nicio metodă nu poate fi folosită corect fără cunoașterea limitelor sale. Cele mai frecvente probleme clinice ale PCR sunt:
Puterea PCR este și slăbiciunea ei: deoarece chiar și o singură moleculă poate fi multiplicată, produsul dintr-o reacție anterioară ajuns în aer poate da un rezultat fals pozitiv. De aceea, camerele separate și fluxul de lucru unidirecțional sunt obligatorii în laboratoarele moleculare.
Hemoglobina sanguină, resturile de formalină din țesut sau heparina pot inhiba enzima. Rezultatul este fals negativ și nu este observat dacă nu există un control intern.
PCR vede numai secvența pentru care ați proiectat primeri. O mutație absentă din panel este raportată drept „fără mutație”. Aceasta înseamnă că un rezultat negativ trebuie citit întotdeauna cu atenție.
Fără activitate de corectare, Taq face aproximativ o eroare la 9.000 de nucleotide. Este neimportantă pentru testele diagnostice, dar importantă în multiplicarea anterioară secvențierii.
În țesuturile incluse în parafină ADN-ul este fragmentat. Țintele lungi nu se multiplică. Eșecul testului este adesea o problemă a probei , nu a metodei.
PCR găsește secvența, dar nu arată că organismul căruia îi aparține este viu sau că celula este activă. Interpretarea se face întotdeauna în context clinic.
Domenii de utilizare a PCR
| Domeniu | Aplicație |
|---|---|
| Oncologie | Teste diagnostice companion (EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA) |
| Scoruri de recidivă bazate pe expresia genelor (test RT-PCR cu 21 de gene) | |
| Monitorizarea răspunsului molecular în malignitățile hematologice (BCR-ABL1) | |
| Determinarea stării de metilare (MGMT) | |
| Genetică | Identificarea purtătorilor și diagnosticul bolilor ereditare |
| Diagnostic prenatal | |
| Testare genetică preimplantațională în fertilizarea in vitro | |
| Infecții | Detectarea agenților patogeni virali și bacterieni |
| Măsurarea încărcăturii virale (HIV, HBV, HCV) | |
| Screeningul cancerului de col uterin bazat pe HPV | |
| Medicină legală | Identificarea persoanei și testarea paternității |
| Obținerea profilului ADN dintr-o cantitate foarte mică de probă | |
| Cercetare | Clonare, multiplicare înainte de secvențiere |
| Studierea interacțiunilor ADN–proteine | |
| Biologie evolutivă și studii ale ADN-ului vechi | |
| Alimentație și industrie | Identificarea speciilor și controlul adulterării |
| Detectarea alergenilor și organismelor modificate genetic |
Situația din Turcia
Testul HPV în programul național de screening
În Turcia, documentul Standardele naționale ale Programului de screening al cancerului de col uterin definește screeningul astfel: „screening populațional al femeilor, începând la 30 de ani și încheindu-se la 65 de ani” și „metoda ideală este screeningul prin test HPV sau test Pap-smear aplicat la fiecare cinci ani”. Testul este legat de intervalul de cinci ani prin afirmația „testul HPV sau Pap-smear se repetă la fiecare cinci ani” .
Prelevarea probei este efectuată de „personal medical instruit în acest domeniu, care lucrează la ASM sau TSM (KETEM)” ; probele prelevate sunt trimise „în condiții de fixare adecvate pentru examinare către centrele stabilite de Instituția de Sănătate Publică din Turcia sau Direcțiile de Sănătate Publică” . Programul se bazează deci pe o structură centralizată de laborator, condiția tehnică prealabilă aplicării populaționale a testului HPV.
Versiunea actuală a documentului, funcționarea de astăzi a programului, mărcile testelor și ratele de acoperire nu au putut fi verificate pentru acest articol. Textul disponibil este documentul oficial care definește standardele programului; pentru detaliile actuale de implementare trebuie consultate sursele Ministerului Sănătății. Pentru imaginea generală a poverii cancerului în țara noastră, puteți consulta articolul statisticile cancerului în Turcia .
Patologia moleculară și rambursarea
Acest articol nu face nicio afirmație despre rambursarea SGK. Dacă testele de scor de recidivă bazate pe expresia genelor precum Oncotype DX, testele diagnostice companion bazate pe PCR sau testele ctDNA/MRD sunt rambursate în Turcia nu a putut fi verificat pentru acest articol. Afirmațiile categorice în circulație trebuie abordate prudent; situația actuală trebuie confirmată prin medicul curant și instituția relevantă. Imaginea generală a accesului la medicamente și teste noi a fost discutată în articolul harta accesului în Turcia la medicamentele oncologice noi aprobate de FDA .
O notă practică: testele pentru mutații precum EGFR, KRAS și BRAF sunt efectuate frecvent în spitalele universitare, spitalele de formare și cercetare și laboratoarele private de patologie moleculară din Turcia. Pentru pacient contează nu doar dacă testul este efectuat , ci și prin ce metodă și cu ce acoperire este efectuat: raportul „nu a fost detectată mutația KRAS” nu poate fi interpretat complet fără cunoașterea codonilor incluși în panel.
Cronologie
Comentariul Academiei DROZDOGAN
Povestea PCR este unul dintre cele mai clare exemple ale răspândirii unei idei bune în medicină. Totuși, la actualizarea articolului a atras atenția mai ales faptul că atât metoda în sine, cât și relatările despre ea necesită verificare .
⚡ De ce contează
Deoarece PCR nu mai este în oncologie o tehnologie de fundal, ci un punct de decizie. Un rezultat RT-PCR cu 21 de gene permite ca mii de femei să nu primească chimioterapie. O măsurare BCR-ABL1 stabilește dacă pacientul continuă tratamentul. Un test EGFR decide medicamentul. Pentru pacient, aceasta înseamnă: „Rezultatul testului nu a sosit” este același lucru cu „nu putem începe tratamentul”. Cunoașterea PCR face parte din înțelegerea propriului proces terapeutic.
✅ Punctul forte
Motivul pentru care PCR rezistă de patruzeci de ani nu este eleganța, ci reproductibilitatea. Aceeași probă, aceiași primeri, același protocol: același rezultat oriunde în lume. Raportarea prin Scala internațională a unei proporții de trei la zece mii în leucemia mieloidă cronică este dovada concretă a standardizării: numărul laboratorului din Ankara poate fi comparat cu cel din Boston. Puține măsurători oncologice sunt atât de bine standardizate.
⚠️ Punctul slab
PCR găsește numai ceea ce căutați . Acesta este aspectul cel mai înșelător al rezultatelor negative: „nu a fost detectată o mutație” înseamnă adesea „nu au fost detectate mutațiile panelului nostru”, iar cele două nu sunt identice. După cum arată exemplul MGMT, două laboratoare cu aceeași metodă pot folosi praguri diferite și oferi rezultate diferite aceluiași pacient. Mai există contaminarea: o metodă care multiplică o singură moleculă o multiplică și dacă aceasta a ajuns în aer. Sensibilitatea PCR este totodată fragilitatea ei.
🩺 Ce trebuie spus pacientului
(1) Când se solicită un test molecular, explicați că rezultatul poate necesita câteva zile până la câteva săptămâni și că așteptarea este de obicei necesară alegerii tratamentului corect. (2) Citiți raportul împreună: arătați genele examinate și metoda folosită. (3) Spuneți că rezultatul „negativ” nu este absolut, ci depinde de acoperirea panelului. (4) Precizați de la început că țesutul insuficient poate necesita repetarea testului sau folosirea unei probe de sânge; aceasta este cea mai frecventă cauză a întârzierilor ulterioare. (5) Amintiți-le că vor întâlni pe internet afirmații precum „testele PCR nu sunt de încredere” și că sursa lor de cele mai multe ori nu privește metoda.
❓ Întrebări deschise
Testele MRD ghidate de tumoră s-au orientat spre secvențiere; poate reveni PCR digitală ca alternativă mai ieftină și mai rapidă? În al doilea rând: la pacientul cu ctDNA pozitiv, dar fără nimic vizibil imagistic, începerea precoce a tratamentului prelungește cu adevărat supraviețuirea sau aflăm doar mai devreme despre recidivă? Aceasta este întrebarea fundamentală încă fără răspuns în MRD. În al treilea rând: de ce se inversează scorurile de recidivă bazate pe expresia genelor după statutul menopauzal? Funcționează chimioterapia însăși sau menopauza pe care o provoacă?
Concluzie: După patruzeci de ani, PCR își păstrează locul, dar nu mai este singură, ci își împarte sarcinile cu secvențierea. Cu extinderea utilizării oncologice, devine mai important decât metoda însăși modul în care este citit raportul său . Și partea care a cerut cel mai mult efort la actualizare nu a fost adăugarea informațiilor noi, ci eliminarea părților greșite din informațiile vechi : toate cele opt afirmații frecvente au necesitat corectare. Se crede că informația nu îmbătrânește; totuși, informațiile cel mai mult repetate îmbătrânesc cel mai repede.
Întrebări frecvente
- În cât timp se obține rezultatul testului PCR?
- Reacția însăși durează de obicei 1–3 ore. Timpul total pentru un rezultat clinic este însă mult mai lung: prelevare, transport la laborator, extracția ADN/ARN, reacție, interpretare și raportare. În oncologie, rezultatul testelor moleculare pe țesut apare de obicei în zile până la săptămâni. Durata provine din întregul proces, nu din lentoarea metodei.
- Ce înseamnă „nu a fost detectată mutația”?
- Înseamnă că nu au fost detectate mutațiile incluse în panelul testat; nu înseamnă că nu există nicio mutație. PCR vede numai secvențele pentru care au fost proiectați primeri. Raportul trebuie să precizeze regiunile genice examinate; dacă nu, trebuie întrebat.
- Care este diferența dintre PCR și secvențierea de nouă generație?
- PCR găsește ceea ce caută, secvențierea citește ceea ce există. PCR este potrivită unei decizii bazate pe o singură mutație cunoscută; secvențierea, realizării hărții moleculare a tumorii. Sunt complementare, nu rivale: FDA continuă să aprobe teste PCR pentru o singură variantă drept teste diagnostice companion.
- Ct mic înseamnă boală severă?
- Ct este invers proporțional cu cantitatea inițială a țintei: Ct mic înseamnă multă țintă. Totuși, Ct este un număr relativ și variază după aparat, kit și tehnica prelevării. Valorile Ct din laboratoare diferite nu se compară direct, iar Ct singur nu măsoară severitatea bolii.
- Diagnosticul cancerului este stabilit prin PCR?
- Nu. Diagnosticul se stabilește prin examinare anatomopatologică, evaluarea microscopică a țesutului. După diagnostic, PCR este folosită pentru determinarea caracteristicilor moleculare ale tumorii , alegerea tratamentului și monitorizarea răspunsului. Excepția o reprezintă screeningul pentru stări precanceroase, precum screeningul HPV; și acolo diagnosticul definitiv este tot anatomopatologic.
- Poate fi detectat cancerul printr-o analiză de sânge?
- ADN-ul tumoral circulant (ctDNA) poate fi detectat, iar domeniul se dezvoltă rapid. Utilizarea actuală principală nu este screeningul , ci alegerea tratamentului și urmărirea recidivei la pacientul diagnosticat. O parte importantă a testelor de monitorizare ghidate de tumoră se bazează acum pe secvențiere, nu PCR; unele nu sunt aprobate FDA, ci funcționează ca teste dezvoltate de laborator.
- Testul PCR poate da rezultate greșite?
- Da. Principala sursă a falselor pozitive este contaminarea: deoarece PCR multiplică și o singură moleculă, produsul ajuns în aer creează probleme. Principalele surse ale falselor negative sunt inhibiția prin sânge, formalină sau heparină, fragmentarea ADN-ului probei și absența variantei căutate din panel. De aceea, un test bun conține control intern.
- Cine a inventat PCR, a fost o singură persoană?
- Ideea îi aparține lui Kary Mullis și pentru ea i-a fost acordat Premiul Nobel pentru Chimie în 1993. Însă studiile care au făcut metoda funcțională, au aplicat-o pentru prima dată unei boli și au permis automatizarea sunt produsul unei echipe ample de la Cetus Corporation; primul articol din 1985 are șapte autori, primul fiind Randall Saiki.
- Se face screening HPV în Turcia?
- Standardele naționale definesc screeningul populațional al femeilor de 30–65 de ani prin test HPV sau Pap-smear la fiecare cinci ani. Personalul medical instruit prelevează proba la ASM ori KETEM și o trimite centrelor stabilite. Detaliile actuale de funcționare și ratele de acoperire nu au putut fi verificate pentru acest articol.
- Aceste teste sunt rambursate în Turcia?
- Articolul nu face nicio afirmație privind rambursarea; statutul în cadrul SGK al testelor de expresie genică precum Oncotype DX, testelor diagnostice companion bazate pe PCR și testelor ctDNA nu a putut fi verificat. Informațiile actuale trebuie confirmate prin medicul curant și instituția relevantă.
Glosar
- Primer
- Fragment sintetic de ADN, de obicei de 18–25 de nucleotide, care se leagă la cele două capete ale secvenței țintă. Delimitează regiunea de multiplicat.
- Tm (temperatura de topire)
- Temperatura la care un primer se separă de jumătate din ținta sa. Temperatura de legare este stabilită cu 3–5 °C mai jos.
- Denaturare
- Separarea termică a ADN-ului dublu catenar în două catene simple.
- Taq-polimerază
- Thermus aquaticus furnizează această ADN-polimerază termorezistentă. Temperatura optimă este 75–80 °C; nu are activitate de corectare 3'→5'.
- Termociclor
- Aparat care modifică temperatura tubului PCR într-o ordine programată.
- RT-PCR
- PCR cu transcripție inversă. ARN-ul este transformat mai întâi în ADNc, apoi multiplicat.
- qPCR / PCR în timp real
- PCR în care multiplicarea este urmărită prin măsurarea fluorescenței la fiecare ciclu. Oferă rezultat cantitativ.
- Ct / Cq
- Numărul ciclului la care semnalul fluorescent depășește pragul. O valoare mică înseamnă multă țintă inițială.
- Sondă TaqMan
- Sondă care poartă la un capăt o moleculă emițătoare de lumină și la celălalt un inhibitor. Fragmentarea ei de polimerază eliberează lumina.
- PCR digitală (dPCR/ddPCR)
- Metodă de împărțire a probei în mii de compartimente și numărare a celor pozitive. Realizează numărare absolută fără curbă standard.
- Test diagnostic companion
- Test aprobat, menționat în eticheta unui medicament, care stabilește cui îi este administrat acel medicament.
- ctDNA
- ADN de origine tumorală circulant în sânge. Ponderea sa în totalul ADN-ului liber este adesea foarte mică.
- Boală reziduală minimă (MRD)
- Boală microscopică nedetectabilă imagistic după tratament, dar demonstrabilă prin metode moleculare.
- Scala internațională (IS)
- Scală standardizată de raportare pentru compararea măsurărilor BCR-ABL1 între laboratoare.
- PCR specifică metilării (MSP)
- PCR cu primeri proiectați pentru a diferenția formele metilate și nemetilate ale ADN-ului.
- Contaminare
- Pătrunderea în probă a ADN-ului din reacții anterioare sau mediu. Principala cauză a falselor pozitive în PCR.
Notă de transparență.
Elemente verificate: 1985 Science : lista completă a autorilor, volumul și paginile articolului; articolul din 1987 al lui Mullis și Faloona din Methods in Enzymology ; laureații și motivarea Premiului Nobel pentru Fiziologie sau Medicină din 1968; sinteza genei de către Khorana în 1972; descoperirea lui Kornberg din 1956 și Nobelul său din 1959; Thermus aquaticus descoperită în 1969 de Brock și Freeze la Yellowstone; purificarea Taq-polimerazei în 1976 de Chien, Edgar și Trela și temperatura sa optimă; timpul de înjumătățire Taq la 95 °C și rata erorilor; relatarea lui Mullis în prelegerea Nobel despre Science și respingerea acesteia; articolul din 1988 din Science despre Taq; „Mr. Cycle” și TC1 DNA Thermal Cycler; împărțirea Premiului Nobel pentru Chimie din 1993 și motivările; opiniile lui Mullis despre HIV-SIDA, climă și astrologie, data decesului și vârsta; studiul Higuchi din 1992; introducerea termenului PCR digitală în 1999 de Vogelstein și Kinzler și sensibilitățile raportate; aprobările sistemului ddPCR clinic, CE în 2017 și FDA în 2019; structura Oncotype DX cu 21 de gene / 16+5 și metoda RT-PCR, pagina producătorului; rezultatele TAILORx și RxPONDER din anunțurile NCI și SWOG; definițiile răspunsului molecular BCR-ABL1; aprobarea FDA din 14 mai 2024 a autoprelevării HPV; faptul că Aptima este test ARNm E6/E7; recomandarea ACS din 2020; datele metaanalizei MGMT; corespondențele dintre producători, PMA și medicamente din lista FDA a diagnosticelor companion; metoda și statutul de reglementare Signatera descrise de producător; textul standardelor turcești de screening cervical.
Elemente neverificate: Sursa primară a anilor descifrării codului genetic (1961, 1966); coautorii studiului Kornberg din 1956 și confirmarea explicită a organismului sursă; numele inginerilor care au realizat „Mr. Cycle”; dezvoltatorii chimiei TaqMan și data primului aparat comercial în timp real; instituția lui Higuchi din 1992; dezvoltatorul și anul metodei LAMP, motiv pentru care nu este inclusă; numărul total de teste efectuate global în pandemie; numărul total de teste PCR aprobate FDA; anii aprobării testelor diagnostice companion, omiși astfel din tabel; profunzimea și durata răspunsului necesare încercării de întrerupere în leucemia mieloidă cronică; confirmarea din sursă primară că testul cobas HPV este PCR în timp real; cifre autoritare privind durata, costurile și sensibilitatea PCR comparativ cu secvențierea de nouă generație; supraviețuirea în glioblastom după statutul MGMT; funcționarea actuală a screeningului cervical în Turcia, mărcile testelor și ratele de acoperire; statutul rambursării SGK (nu a fost făcută nicio afirmație).
Natura corecțiilor: Tabelul cu opt corecții rezultă din compararea afirmațiilor din versiunea anterioară și sursele turcești frecvente cu surse primare și secundare. Concluzia că afirmația „15 reviste au respins” nu este susținută ne aparține: nu a fost găsită o sursă sigură care să o susțină, în schimb sunt documentate două respingeri, Nature și Science. Evaluarea necesității separării metodei științifice a lui Mullis de opiniile sale personale aparține de asemenea acestui articol.
Declarație de interese: Nu avem legături cu niciun test, aparat sau producător menționat în acest articol.
Surse
- Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. „Amplificarea enzimatică a secvențelor genomice β-globină și analiza situsului de restricție pentru diagnosticul anemiei falciforme.” Science 1985;230(4732):1350–1354.
- Mullis KB, Faloona FA. „Sinteza specifică a ADN-ului in vitro printr-o reacție în lanț catalizată de polimerază.” Methods in Enzymology 1987;155:335–350.
- Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. „Amplificarea enzimatică a ADN-ului dirijată de primeri, cu o ADN-polimerază termostabilă.” Science 1988;239(4839):487–491.
- Chien A, Edgar DB, Trela JM. „ADN-polimeraza termofilului extrem Thermus aquaticus.” Journal of Bacteriology 1976;127(3):1550–1557.
- Premiul Nobel pentru Chimie 1993 — Kary B. Mullis și Michael Smith. nobelprize.org
- Mullis KB. Prelegerea Nobel, 8 decembrie 1993. nobelprize.org
- Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină 1968 — Holley, Khorana, Nirenberg. nobelprize.org
- Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină 1959 — Ochoa, Kornberg. nobelprize.org
- Higuchi R și colaboratorii. „Amplificarea și detectarea simultană a secvențelor specifice de ADN.” Bio/Technology 1992.
- Vogelstein B, Kinzler KW. Definirea conceptului de PCR digitală, 1999.
- National Cancer Institute. „Studiul TAILORx: chimioterapia nu este benefică multor femei cu cancer de sân precoce.” Comunicat de presă, 2018. cancer.gov
- SWOG Cancer Research Network. Anunț despre publicarea rezultatelor RxPONDER în NEJM, 3 decembrie 2021. swog.org
- Exact Sciences. Oncotype DX Breast Recurrence Score — pagina profesioniștilor din sănătate. exactsciences.com
- U.S. Food and Drug Administration. „Lista dispozitivelor diagnostice companion autorizate sau aprobate (instrumente in vitro și imagistice).” fda.gov
- National Cancer Institute. „FDA aprobă autoprelevarea pentru testele HPV.” Cancer Currents Blog, 2024. cancer.gov
- American Cancer Society. Ghidul screeningului cancerului de col uterin, 2020. pressroom.cancer.org
- Hologic. Informații despre produsul Aptima HPV — ARNm E6/E7. hologic.com
- Metaanaliza comparativă a metodelor de determinare a metilării promotorului MGMT. Neuro-Oncology 2021;23(9):1457.
- Natera. Signatera — pagina de informații pentru clinicieni. natera.com
- National Cancer Institute. „Testarea biomarkerilor pentru tratamentul cancerului.” cancer.gov
- Ministerul Sănătății al T.C. Standardele naționale ale Programului de screening al cancerului de col uterin.
- Brock TD, Freeze H. Thermus aquaticus: izolarea, 1969.
Ți-a fost util acest articol?
Feedbackul tău ne ajută să îmbunătățim conținutul.
Comentariile cititorilor
Împărtășește comentariul tău
Numele și comentariul dumneavoastră sunt publicate numai după aprobarea administratorului. Adresa de e-mail nu este afișată niciodată vizitatorilor.
Fii primul care comentează.