Tıbbi Onkolog Prof. Dr. Mustafa Özdoğan Memorial Antalya Hastaneler Grubu Onkoloji Merkezi Başkanı "Kanser alanındaki en büyük eksiklik, halka yönelik sade ve anlaşılabilir bilgiye ulaşılamamasıdır. Web sitemiz ile bu eksikliği giderdiğimizi düşünüyorum."

Anasayfa - Kanser Haberleri - Genetik - Serviks (rahim ağzı) kanseri - Polimeraz zincir reaksiyonu nedir? PCR tarihçesi, nasıl yapılır ve tıbbi önemi
Polimeraz zincir reaksiyonu nedir? PCR tarihçesi, nasıl yapılır ve tıbbi önemi

Polimeraz zincir reaksiyonu nedir? PCR tarihçesi, nasıl yapılır ve tıbbi önemi

Yazı Boyutu:
Küçült
Sıfırla
Büyült
28.04.2018

PCR nedir?

Polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction, PCR), herhangi bir organizmaya ait DNA’daki istenen bölgelerin çoğaltılmasını sağlayan yönteme verilen addır. İlk olarak ABD kökenli Cetus şirketinde çalışan Henry A. Erlich, Kary B. Mullis ve Randall K. Saiki tarafından 1985 yılında bilim dünyasına sunulmuştur ve bu buluşundan dolayı Mullis, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülü’nü Michael Smith ile paylaşmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonunun moleküler biyoloji ve tıptaki gelişmeler büyük ivme kazanmıştır. PCR olmasa bugünkü modern tıp olmazdı.

Polimeraz zincir reaksinonunun (PCR) tarihçesi

Polimeraz zincir reaksinonu, moleküler fotokopi olarak adlandırılan bir tekniktir. PCR, İnsan Genom Projesi’nin merkezinde yer almıştır. Akıllı ilaçların moleküler hedeflerinin bulunması için genetik tanı testlerinde ve yeni nesil dizileme (next generation sequencing, NGS) teknolojilerinde kullanılmasıyla PCR, genetik bilimin önemli basamağı olarak kendini geliştirmiştir.

Biyolojik bilimler, anlayışımızı geliştirmek için sıfırdan birşeyler ortaya çıkarmak yerine, genellikle önceki keşiflerden güç almaktadır. Mendel’in kalıtımın temellerini atması DNA’nın keşfine; DNA’nın keşfinin ise, birçok hastalığın nedenlerinin anlaşılmasını sağlayan PCR gibi DNA dizileme tekniklerinin keşfine olanak sağlamıştır.

1966 yılında Nirenberg, Khorana ve Holley’in genleri yapay olarak sentezleyerek genetik kodu tanımlamaları bir başka önemli kilometre taşıdır. Böylelikle kalıtsal kodun hangi sıra ile okunduğu, kodun başlangıç ve bitiş noktalarının nasıl belirlendiği bulundu. H. Gobind Khorana, protein sentezinde genetik kod ve işlevlerinin yorumlanması hakkında yaptığı araştırmalardan ötürü Nobel Ödülü’nü kazanmıştır.

Polimeraz zincir reaksiyonunun keşfi de daha öncesinde yapılan araştırmalar ile mümkün olmuştur; örneğin DNA polimeraz adlı enzim gibi. Enzimler, hücrelerde bir tepkimeye yol açan ve onu hızlandıran, protein yapısında, eriyebilir organik maddelerdir. 1956 yılında, Nobel Ödüllü Arthur Kornberg ve arkadaşları tarafından Escherichia coli adlı bakteride “DNA polimeraz 1” enzimi keşfedilmiştir. Bu keşif DNA’nın kendini nasıl eşlediğinin anlaşılmasına yol açmıştır. Bununla birlikte laboratuvarlarda kullanılmak üzere yeteri kadar anlamlı sonuç verebilen stabil DNA polimerazın bir türünü keşfetmek biyologların bir 20 yılını daha alacaktı.

1976 yılında, Cincinnati Üniversitesi’nden bir grup araştırmacı kaplıca gibi çok sıcak sularda yaşayan termofilik bir bakteri olan Thermus aquaticus’tan Taq polimeraz enzimini keşfetti. Taq polimeraz enzimi, polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan, yüksek sıcaklıklara (94 °C) dayanabilen bir enzimdir.

1983 yıllarında Kary Mullis, California’da Cetus Corporation’da oligonükleotit (kısa DNA parçaları) sentezi üzerinde çalışırken hücredeki DNA sentezinin laboratuvar şartlarında teknik olarak gerçekleşebileceğini gözlemler. Mullis, tanımladığı bu yeni reaksiyonda “erime, bağlanma ve sentez” olarak adlandırlan her adımda sıcaklıkların özenle kontrol edilmesi ve buna ek olarak DNA polimeraz kullanarak farklı sıcaklıklardaki üç olayın çevrimler halinde tekrarının yapılması gerektiğini bulur. İki yıl sonra Cetus ekibi, Amerikan İnsan Genetiği Derneği’nin yıllık toplantısında çalışmalarını sunar. Daha sonra yöntem ilk olarak Science dergisinde yayımlarla. İşin enteresanı geleceği değiştirecek kadar önemli olan polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi hakkındaki bu makale, yaklaşık olarak 15 farklı dergi tarafından reddedilmişti.

Bilim dünyasının yeni yöntemi yavaş kabullenmesi üzerine Cetus araştırmacıları orjinal yöntemi geliştirdiler. 1986 yılında, bilim insanları yöntemde hataları azaltıp ısıya hassas olan DNA polimeraz yerine Taq polimeraz kullanıldı. Böylelikle bu enzimin uzun sıcaklık derecelerine oldukça dayanıklı olması ile tüm döngüler boyunca verimli şekilde DNA sentezi yapabiliyordu. Bir yıl sonra, ABD kökenli uluslararası bir şirket olan Perkin Elmer’de çalışan bilim insanları PCR'de ısıtma ve soğutma sağlayan makine parçaları düzenlemek için termal döngüyü icat ettiler.

Son 20 yılda daha yüksek verimli ve kullanımı basit PCR makineleri oluşturmak için birçok şirket, AR-GE faaliyetleri için milyarca dolar harcama gerçekleştirdi.

PCR yönteminin kullanımına en güzel örneklerden biri, serviks (rahim ağzı) kanseri taramasında kullanılan HPV DNA testidir. Serviks kanseri, gelişmiş ülkelerde sıklığı azalmakla birlikte, dünya genelinde kadınlarda en yaygın görülen ikinci kanserdir. Serviks kanserlerinin hemen hepsi HPV adlı virüs nedeni ile oluşmaktadır. Pap-smear adlı tarama yöntemi ile serviks kanserinde erken tanı veya kanser daha oluşmadan HPV enfeksiyonuna bağlı hücresel değişiklikleri tespit etmek mümkündür.

Rahim ağzı hücrelerinin DNA’sına HPV virüs DNA’sından parçalar yerleşmesi sonucu oluşan kronik enflamasyon, serviks kanserinin nedenidir. HPV DNA testi adı verilen PCR tekniği ile, rahim ağzı bölgesinden smear yöntemi ile alınan hücrelerin içinde HPV DNA’sı bulunabilir. Bu şekilde PCR ile eğer virüs genomu rahim ağzı hücrelerinde tespit edilirse HPV DNA pozitif” denir.

- HPV aşısının keşfinin arkasındaki hikaye

Polimeraz zincir reaksiyonu – PCR nasıl yapılır?

PCR basitçe, nükleotitlerin uygun koşullarda tüpte çoğaltılması işlemidir. Belli bir DNA parçasının kopyalarının primer adı verilen yapılar tarafından yönlendirilerek enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro (canlı dışında, tüpte) bir yöntemdir.

Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki nükleotid dizilerini tamamlayıcı bir çift sentetik DNA parçası (primer) kullanılarak, bu iki primerle sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.

Polimeraz zincir reaksiyonunda üç temel basamak vardır ve çoğaltılmış ürünün miktarı, bu üç adımın tekrarlanma sayısına bağlıdır:

1. Denatürasyon: DNA’nın iki zincirinin yüksek sıcaklıkta birbirinden ayrılmasıdır. 94 – 98 santigrad derecede

2. Primer bağlanması (annealing, hibridizasyon): Sentetik olgonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanmasıdır. 37 – 65 derecede

3. Uzama (extension, polimerizasyon): Zincirin uzaması veya DNA polimerazın primerleri uzatmasıdır. 72 derecede

PCR kullanım alanları

• Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı,

• Prenatal tanıda,

• Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması,

• Adli tıpta,

• Onkogenezin (kanser oluşumu, nedenleri) araştırılmasında,

• Klonlamada, gen tanısı araştırmalarında,

• Nokta mutasyonlarının belirlenmesinde,

• DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında,

• Bilinmeyen dizi tayininde,

• Evrimin aydınlatılmasında,

• İn vitro fertilization yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmasında,

• DNA-protein interaksiyonunun araştırılmasında,

PCR’nin yukarıda sayılanların dışında da geniş bir kullanım alanı bulunmaktadır. Örneğin et ve et ürünlerinde tür tayini, katkı maddelerinde domuz DNA'sı aranması, allerjenlerin tespiti gibi. Bu açıdan PCR yöntemlerinin kullanılması gıda sektörü açısından önemli avantajlar sağlamaktadır.

PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; birçok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale getirmiştir.

PCR belirli bir geni çoğaltmak için oldukça iyi bir araç olmakla birlikte, birden fazla gene ait çalışmaları PCR ile gerçekleştirdiğinizde DNA dizileme maliyetinin ve hata oranlarının fazla olması gibi sorunlar yeni nesil dizileme teknolojisini doğurmuş ve ve birçok araştırmacıyı PCR makineleri ve yöntemlerini modernize etmelerini sağlamıştır.

- Yeni nesil dizileme (Next-Generation Sequencing, NGS) nedir? Onkolojide kullanımı

Sağlıklı ve mutlu kalın...
Daha fazla veya daha az alkışlayarak, bize hangi yazılarımızın daha fazla ilgi çektiğini gösterebilirsiniz.
Kaynak:

1. The Nobel Prize in Chemistry 1993.
nobelprize.org

2. Jeffrey S. Buguliskis, Ph.D.
PCR Has a History of Amplifying Its Game. A GEN 35th Anniversary Retrospective.
genengnews.com
Sayfada yer alan yazılar sadece bilgilendirme amaçlıdır, tanı ve tedavi için mutlaka doktorunuza başvurunuz.
İlgili Kanser Haberleri
BRAF pozitif 4. evre akciğer kanserinde dabrafenib ve trametinibin başarısı
BRAF pozitif 4. evre akciğer kanserinde dabrafenib ve trametinibin başarısı
Siz ne yerseniz ben de onu yiyorum – anne beslenmesi ve epigenetik
Siz ne yerseniz ben de onu yiyorum – anne beslenmesi ve epigenetik
EGFR mutasyonu nedir? Akciğer kanserinde egfr testi nasıl yapılır?
EGFR mutasyonu nedir? Akciğer kanserinde egfr testi nasıl yapılır?
Prostat kanserinde tedaviye yanıtı önceden tahmin etmek için, androjen reseptör gen varyantına bakılabilir
Prostat kanserinde tedaviye yanıtı önceden tahmin etmek için, androjen reseptör gen varyantına bakılabilir