Polimeraz Zincir Reaksiyonu Nedir? PCR Tarihçesi, Nasıl Yapılır ve Tıbbi Önemi
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir DNA parçasının laboratuvar ortamında milyonlarca kez kopyalanmasını sağlayan yöntemdir. 1983'te bir gece yolculuğunda akla gelen bu fikir, kırk yılda genetik tanının, kanser tedavisi seçiminin, adli tıbbın ve bir küresel salgının test altyapısının temeli oldu. Bu yazı PCR'ı baştan anlatıyor; ayrıca konu hakkında yaygın biçimde dolaşan birkaç yanlış bilgiyi kaynağıyla birlikte düzeltiyor.
PCR'ı anlamanın en kolay yolu şu benzetmedir: elinizde tek bir sayfa var ve onu okuyamayacak kadar soluk. PCR, o sayfayı milyarlarca kez fotokopi çekerek okunur hâle getirir. Ama önemli bir farkla — fotokopi makinesi tüm sayfayı çeker, PCR ise yalnızca sizin işaretlediğiniz paragrafı çoğaltır. İşaretleme işini primer adı verilen kısa sentetik DNA parçaları yapar. Bu seçicilik, yöntemi bir kopyalama aracı olmaktan çıkarıp bir tanı aracına dönüştüren şeydir.
Onkoloji açısından PCR soyut bir laboratuvar tekniği değildir. Meme kanserinde kemoterapi alıp almama kararını veren 21 genlik test bir RT-PCR testidir. Kronik miyeloid lösemide hastanın tedaviye yanıtı PCR ile ölçülür. Rahim ağzı kanseri taramasında kullanılan HPV testi PCR temellidir. Akciğer kanserinde hangi akıllı ilacın verileceğine karar veren EGFR testi PCR'dır. Yani PCR, onkolojide "arka plandaki teknoloji" değil, tedavi kararının kendisidir.
PCR nedir, tek cümleyle? Bir DNA dizisinin, iki ucundan sentetik primerlerle sınırlandırılıp, ısıtma–soğutma döngüleriyle ve ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz enzimiyle üstel olarak çoğaltılması. Her döngüde kopya sayısı teorik olarak ikiye katlanır; 30 döngü sonunda tek bir molekülden yaklaşık bir milyar kopya elde edilir.
PCR nasıl çalışır? Üç adım
PCR'ın tamamı, sıcaklığı belirli bir sırayla değiştirmekten ibarettir. Bir tüpün içinde hedef DNA, iki primer, DNA polimeraz enzimi, dört nükleotit (A, T, G, C) ve uygun bir tampon çözelti bulunur. Cihaz — termal döngü cihazı — bu tüpün sıcaklığını otomatik olarak değiştirir.
| Adım | Sıcaklık | Süre | Ne oluyor? |
|---|---|---|---|
| 1. Denatürasyon | 94–98 °C | 20–30 saniye | Çift sarmalı bir arada tutan hidrojen bağları kopar; iki zincir ayrılır. |
| 2. Primer bağlanması (annealing) |
50–65 °C | 20–40 saniye | Sentetik primerler hedef bölgenin iki ucuna oturur ve çoğaltılacak alanı sınırlandırır. |
| 3. Uzama (extension) |
72 °C | Uzunluğa göre değişir | DNA polimeraz primerin ucundan başlayarak yeni zinciri sentezler. |
Bu üç adım 25–40 kez tekrarlanır. Kopya sayısı her döngüde teorik olarak ikiye katlanır.
Bir düzeltme: bağlanma sıcaklığı "37–65 °C" değildir. İnternette ve birçok Türkçe kaynakta primer bağlanma sıcaklığı 37 °C'den başlayan bir aralık olarak verilir. Bu, PCR'ın ilk yıllarına, ısıya dayanıksız Klenow enziminin kullanıldığı 1983–1985 dönemine ait bir bilgidir. Modern PCR'da bağlanma sıcaklığı primerlerin erime sıcaklığının (Tm) yaklaşık 3–5 °C altına ayarlanır; tipik 18–25 nükleotitlik primerlerin Tm değeri 55–65 °C olduğu için pratik aralık 50–65 °C'dir. 37 °C'de çalışmak, primerlerin yanlış yerlere yapışmasına — yani özgül olmayan ürünlere — yol açar. Aradaki fark akademik değildir: bir tanı testinde bu, yanlış pozitif demektir.
Neden ısıya dayanıklı enzim şart?
PCR'ın ilk hâlinde büyük bir pratik sorun vardı. Her döngüde DNA'yı ayırmak için tüp 94 °C'ye çıkarılıyordu; bu sıcaklık DNA'yı ayırıyor ama enzimi de bozuyordu. Dolayısıyla her döngünün başında tüpün kapağını açıp elle yeni enzim eklemek gerekiyordu. 30 döngülük bir deney, 30 kez elle enzim ekleme demekti — otomasyon imkânsızdı.
Çözüm, sıcak su kaynaklarında yaşayan bir bakteriden geldi. Thermus aquaticus'un DNA polimerazı — kısaca Taq polimeraz — 75–80 °C'de en iyi çalışır ve 95 °C'de bile yaklaşık 40 dakikalık yarı ömre sahiptir. Taq'ın PCR'a girmesiyle tüpün kapağını açmaya gerek kalmadı; süreç tamamen otomatikleşti. PCR'ı bir laboratuvar numarasından bir endüstriyel standarda dönüştüren adım budur.
Taq'ın bir zayıflığı vardır: 3'→5' düzeltme (proofreading) aktivitesi yoktur, yani kopyalarken yaptığı hatayı geri dönüp düzeltemez. Orijinal enzim için bildirilen hata oranı yaklaşık 9.000 nükleotitte birdir. Bu, çoğu tanı uygulaması için sorun değildir — ama dizileme ya da klonlama gibi tek bir harfin önemli olduğu işlerde, düzeltme aktivitesi olan başka ısıya dayanıklı polimerazlar (Pfu, Phusion gibi) tercih edilir. "PCR yapıldı" demek, tek bir enzimle tek bir yöntem uygulandı demek değildir.
PCR'ın tarihçesi — ve dolaşımdaki sekiz yanlış
PCR'ın hikâyesi Türkçe kaynaklarda büyük ölçüde doğru anlatılır, ama birkaç tarih ve bir efsane sürekli tekrarlanır. Aşağıdaki tablo, bu yazının önceki sürümünde de yer alan ve internette yaygın biçimde dolaşan ifadeleri, doğrulanmış karşılıklarıyla yan yana koyuyor.
| Dolaşan ifade | Doğrusu |
|---|---|
| "1985'te Erlich, Mullis ve Saiki tarafından sunuldu" | Makalenin yedi yazarı vardır ve ilk yazar Saiki'dir: Saiki, Scharf, Faloona, Mullis, Horn, Erlich, Arnheim. Science 1985;230(4732):1350–1354. |
| "1966'da Nirenberg, Khorana ve Holley genetik kodu çözüp yapay gen sentezledi; Khorana bununla Nobel aldı" | Nobel 1968'de verildi ve gerekçesi "genetik kodun ve protein sentezindeki işlevinin yorumlanması"ydı — yapay gen değil. Khorana'nın ilk tam gen sentezi 1972'dir, Nobel'den dört yıl sonra. |
| "1976'da keşfedilen Taq polimeraz, Thermus aquaticus'tan elde edilmiştir" | İki ayrı olay birleştirilmiş. Bakteri 1969'da Thomas Brock ve Hudson Freeze tarafından Yellowstone'da bulundu. Enzim 1976'da Chien, Edgar ve Trela tarafından saflaştırıldı (J Bacteriol 1976;127:1550–1557). |
| "94 °C'ye dayanıklı enzim" | Doğru ama eksik: Taq'ın optimum çalışma sıcaklığı 75–80 °C'dir; 95 °C'de yarı ömrü yaklaşık 40 dakika, 92,5 °C'de 2 saatin üzerindedir. |
| "Makale yaklaşık 15 dergi tarafından reddedildi" | Desteklenmiyor. Belgelenen iki red vardır: Nature ve Science. Mullis, Nobel dersinde Science reddini kendisi anlatır. Yöntem makalesi 1987'de Methods in Enzymology'de yayımlandı. "15 dergi" için güvenilir bir kaynak bulunamamıştır. |
| "1986'da Taq polimeraz PCR'a eklendi" | Taq'lı PCR'ı tanımlayan makale 1988 tarihlidir: Saiki ve ark., Science 1988;239(4839):487–491. |
| "Bir yıl sonra Perkin Elmer termal döngü cihazı geliştirdi" | Sıra tersine dönmüş. Cetus'un prototip cihazı "Mr. Cycle" 1985–86'da yapıldı; ilk ticari cihaz Perkin-Elmer Cetus'un TC1 DNA Thermal Cycler'ı, 1987. Yani cihaz, Taq makalesinden önce geldi. |
| "Primer bağlanması 37–65 °C" | Modern PCR'da 50–65 °C; primer Tm'inin 3–5 °C altı. 37 °C, Klenow enzimiyle çalışılan 1983–85 dönemine aittir. |
Bu düzeltmelerin içinde en öğretici olanı beşincisidir. "Dâhinin makalesini 15 dergi reddetti" anlatısı, bilim iletişiminde çok sevilen bir kalıptır: sistem kör, birey haklı. Gerçek hikâye daha ilginç ve daha gerçekçi — iki büyük dergi reddetti, yöntem bir yöntem dergisinde yayımlandı, ve asıl atılımı sağlayan 1985 tarihli uygulama makalesi zaten Science'ta çıkmıştı. Yani sistem kör değildi; fikrin kendisi, işe yaradığı gösterilene kadar ikna edici bulunmamıştı. Bu, bilimin nasıl çalıştığına dair "15 red" efsanesinden çok daha doğru bir anlatıdır.
Fikrin geldiği gece
Mullis'in kendi anlatımına göre fikir, 1983 baharında bir cuma gecesi, Berkeley'den kuzey Kaliforniya'daki kulübesine giderken 128 numaralı karayolunda aklına geldi. Arabayı kenara çekti, torpido gözünden kâğıt çıkarıp yazdı. Nobel biyografisinde bu anı, "Kaliforniya at kestaneleri çiçekteyken" diye tarif eder. Yöntemin başarılı ilk gösterimi 16 Aralık 1983 olarak kaydedilmiştir.
Fikrin özü aslında basittir ve tam da bu yüzden kimsenin aklına gelmemiştir: DNA polimeraz zaten biliniyordu (1956), primerler zaten sentezlenebiliyordu, sıcaklıkla DNA'nın ayrıldığı zaten biliniyordu. Mullis'in yaptığı yeni bir molekül bulmak değil, bilinen üç şeyi bir döngü içine koymaktı. Üstel çoğalma buradan çıktı.
İlk yayımlanan uygulaması bir tanı testiydi. 1985 tarihli Science makalesinin konusu temel biyoloji değil, orak hücre anemisinin tanısıydı: β-globin geninin çoğaltılıp restriksiyon analiziyle incelenmesi. PCR, dünyaya bir araştırma aracı olarak değil, doğrudan bir klinik tanı aracı olarak tanıtıldı. Kırk yıl sonra onkolojideki yerini düşününce, bu başlangıç anlamlı görünüyor.
Kary Mullis: yöntem ile insanı ayırmak
Mullis, 1993 Nobel Kimya Ödülü'nü Michael Smith ile paylaştı; Smith ödülü bölgeye yönelik mutagenez (site-directed mutagenesis) çalışmalarıyla aldı. Mullis'in gerekçesi tek cümleydi: "polimeraz zincir reaksiyonu yöntemini icat etmesi."
Ancak Mullis'in sonraki yılları, bilim tarihinin rahatsız edici örneklerinden biridir. Belgelenmiş biçimde HIV'in AIDS'e neden olduğunu reddetti — bu iki alanın hiçbirinde araştırma geçmişi olmamasına rağmen. İnsan kaynaklı iklim değişikliğini ve ozon incelmesini küçümsedi, bilim insanlarının fon için işbirliği yaptığını öne sürdü. Astrolojiye inandığını açıkladı ve otobiyografisinde, dünya dışı bir varlık olabileceğini düşündüğü parlayan, konuşan bir rakunla karşılaştığını anlattı. 7 Ağustos 2019'da, 74 yaşında, zatürre komplikasyonlarından hayatını kaybetti.
Bunu yazmak gereklidir, çünkü tam tersi bir akıl yürütme çok yaygındır. "PCR'ı bulan adam HIV–AIDS bağını reddediyordu" cümlesi, salgın döneminde PCR testlerini itibarsızlandırmak için defalarca kullanıldı. Akıl yürütme her iki yönde de hatalıdır: Nobel almış olmak insanı her konuda haklı yapmaz; bir insanın başka konularda yanılması da onun yönteminin geçersiz olduğunu göstermez. PCR, Mullis'in görüşlerinden bağımsız olarak, kırk yıldır milyonlarca deneyde tekrarlanabilir sonuç verdiği için geçerlidir. Bir yöntem, mucidinin otoritesiyle değil, tekrarlanabilirliğiyle ayakta durur. Bu ayrım, kanser hastalarının karşısına çıkan "şu ünlü bilim insanı şunu söylemişti" tipindeki iddialar için de geçerli bir süzgeçtir.
PCR tek bir yöntem değil: dört kuşak
1980'lerin PCR'ı ile bugün bir onkoloji laboratuvarında çalışan PCR aynı şey değildir. Yöntem dört kuşakta evrildi ve her kuşak, bir öncekinin cevaplayamadığı bir soruyu cevaplamak için doğdu.
| Kuşak | Yıl | Cevapladığı soru | Ölçüm biçimi |
|---|---|---|---|
| Klasik (uç nokta) PCR | 1983–85 | "Bu dizi var mı, yok mu?" | Döngüler bitince jelde bant var mı bakılır — niteliksel |
| RT-PCR (ters transkripsiyon) |
1980'lerin sonu | "Bu RNA var mı? Bu gen ne kadar ifade ediliyor?" | RNA önce cDNA'ya çevrilir, sonra çoğaltılır |
| Gerçek zamanlı PCR (qPCR) | 1992 | "Ne kadar var?" | Her döngüde floresan ölçülür — göreli niceliksel |
| Dijital PCR (dPCR/ddPCR) | 1999 (kavram) | "Kaç tane molekül var? Ve 100.000 normal molekülün arasındaki 1 mutantı bulabilir misin?" | Örnek binlerce damlacığa bölünür, pozitif damlacıklar sayılır — mutlak niceliksel |
Gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve Ct değeri
Klasik PCR'ın sorunu şuydu: reaksiyon bittikten sonra bakıyordunuz ve o noktada tüpteki malzeme tükenmiş, çoğalma platoya oturmuş oluyordu. Başlangıçta 10 kopya olanla 10.000 kopya olan, sonunda benzer bant veriyordu. Yani "var mı" sorusuna cevap verebiliyordunuz ama "ne kadar var" sorusuna veremiyordunuz.
1992'de Higuchi ve arkadaşlarının yayımladığı çalışma bunu değiştirdi: çoğalmayı bittikten sonra değil, olurken izlemek. Tüpe floresan veren bir sistem konur ve cihaz her döngüde ışığı ölçer. Yaygın kullanılan TaqMan kimyasında, hedefe bağlanan bir prob vardır; bu probun bir ucunda ışık veren molekül, diğer ucunda onu bastıran bir söndürücü (quencher) bulunur. Taq polimeraz uzama sırasında proba çarpıp onu parçalar, iki uç birbirinden ayrılır ve ışık serbest kalır. Işık artışı, çoğalma miktarıyla orantılıdır.
Ct (veya Cq) nedir? Floresan sinyalinin eşiği geçtiği döngü numarasıdır (threshold cycle / quantification cycle; MIQE kılavuzu "Cq" terimini tercih eder). Mantığı terstir ve sık karıştırılır: Ct ne kadar düşükse, başlangıçtaki hedef miktarı o kadar yüksektir. Çünkü çok sayıda kopyayla başlayan bir reaksiyon eşiği erken geçer. Salgın döneminde "Ct değerim 32, az mı virüs var?" tartışmalarının kaynağı budur — ve o tartışmaların çoğu, Ct'nin cihaz ve protokole göre değişen göreli bir sayı olduğunu atlıyordu.
Dijital PCR: sayarak ölçmek
qPCR göreli ölçüm yapar — bir referansa göre "şu kadar kat fazla" der. Dijital PCR ise farklı bir mantık kurar: örneği binlerce küçük bölmeye (damlacığa) ayırır, öyle ki her bölmeye ya bir hedef molekül düşer ya hiç düşmez. Döngüler bittikten sonra kaç bölmenin pozitif olduğunu sayar. Poisson istatistiğiyle başlangıçtaki molekül sayısı doğrudan hesaplanır — standart eğriye gerek kalmadan.
Kavramı 1999'da Bert Vogelstein ve Kenneth Kinzler adlandırdı ve ilk gösterdikleri uygulama tam da bu yazının konusuyla ilgiliydi: nadir kanser mutasyonlarının saptanması. Öncülleri de vardı — Cetus araştırmacıları 1988'de seyreltmeyle tek bir β-globin kopyasının saptanabildiğini göstermiş, Morley ve Sykes 1992'de sınırlayıcı seyreltmeyi niceliksel bir teknik hâline getirmişti.
Dijital PCR'ın onkolojide önemi tek bir özelliğinden gelir: nadir olanı bulabilmesi. Bildirilen performans şudur — mutant DNA, 200.000 kat fazla normal DNA arasında saptanabilmekte; klasik qPCR'a göre yaklaşık 2.000 kat daha duyarlı olduğu belirtilmektedir; 1.250.000 hücrede bir kadar seyrek diziler yakalanabilmektedir. Kanda dolaşan tümör DNA'sının (ctDNA) tüm serbest DNA içindeki payı çoğu zaman binde birin altında olduğu için, bu duyarlılık düzeyi lüks değil, ön koşuldur. İlk klinik kullanım için onaylanan damlacık dijital PCR sistemi 2017'de CE işareti, 2019'da kronik miyeloid lösemi için FDA onayı almıştır.
RT-PCR ve salgın
RNA doğrudan çoğaltılamaz; önce ters transkriptaz enzimiyle DNA'ya (cDNA) çevrilmesi gerekir. Bu adımın eklendiği yönteme RT-PCR denir. SARS-CoV-2 bir RNA virüsü olduğu için testi de bu mantıkla kuruldu: önce ters transkripsiyon, sonra gerçek zamanlı çoğaltma — yani RT-qPCR. Tek bir kapalı çalışmada hem saptama hem niceleme yapabilmesi, onu referans test hâline getirdi.
Salgının PCR açısından en kalıcı dersi, yöntemin gücüyle değil sınırıyla ilgilidir. PCR, hedef diziyi bulur — o dizinin canlı ve bulaştırıcı bir organizmaya ait olup olmadığını söylemez. Enfeksiyon geçtikten sonra haftalarca saptanabilen viral RNA parçaları bu yüzden pozitif sonuç verebiliyordu. Aynı sınır onkolojide de geçerlidir ve daha az konuşulur: PCR bir mutasyonun varlığını gösterir, o mutasyonu taşıyan hücrenin tümörü büyütüp büyütmediğini göstermez. Yöntemi doğru kullanmak, ne söylediğini olduğu kadar ne söylemediğini de bilmeyi gerektirir. Salgın sırasında dünyada yapılan toplam test sayısına ilişkin güvenilir bir rakam bu yazı için doğrulanamamıştır; bu nedenle bir sayı verilmemiştir.
PCR onkolojide: dört somut örnek
PCR'ın kanser tıbbındaki yeri "araştırmalarda kullanılıyor" ifadesinin çok ötesindedir. Aşağıdaki dört örnek, PCR sonucunun doğrudan tedavi kararı hâline geldiği durumlardır.
1. Meme kanserinde kemoterapi kararı: Oncotype DX
Hormon reseptörü pozitif, HER2 negatif erken evre meme kanserinde en zor sorulardan biri şudur: bu hastaya ameliyat sonrası kemoterapi vermeli miyiz? Oncotype DX Breast Recurrence Score testi bu soruya, tümör dokusundaki gen ifadesine bakarak cevap arar. Üreticinin tanımıyla test, 21 genin ifadesini değerlendirir — 16 kanser ilişkili gen ve 5 referans gen — ve bunu yapmak için "tümör RNA'sını analiz etmek üzere ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)" kullanır. Örnek, kesici iğne biyopsisi veya cerrahi çıkarım sırasında alınan dokudur.
| Çalışma | Hasta | Popülasyon | Sonuç |
|---|---|---|---|
| TAILORx | 10.273 | Lenf nodu negatif, skor 11–25 olanlar randomize edildi | 9 yılda invaziv hastalıksız sağkalım %83,3 (tek başına endokrin) — %84,3 (endokrin + kemoterapi); genel sağkalım %93,9 – %93,8. Yani kemoterapinin kazancı yok. İstisna: 50 yaş ve altında, skor 16–25 olan grupta küçük bir kazanç görüldü. |
| RxPONDER | 5.083 | 1–3 lenf nodu pozitif, skor ≤25 | 5 yılda invaziv hastalıksız sağkalım — menopoz sonrası: %91,9'a karşı %91,3 (fark yok); menopoz öncesi: %89,0'a karşı %93,9 (kemoterapi lehine). |
Kaynaklar: NCI basın bülteni (TAILORx) ve SWOG duyurusu (RxPONDER).
Buradaki asıl haber, testin hangi hastaya kemoterapi verdiği değil, hangisine vermediğidir. TAILORx'in sonucu, lenf nodu negatif ve skoru orta düzeyde olan on binlerce kadının kemoterapiden ve onun kalıcı yan etkilerinden kurtulmasını sağladı — ve bunu sağlayan şey bir RT-PCR testidir. RxPONDER ise menopoz durumuna göre sonucun tersine döndüğünü göstererek tek bir sayının her hastada aynı anlama gelmediğini ortaya koydu. Bu kararın klinik ayrıntısını meme kanseri ameliyatı sonrası kemoterapi almayacak hastalar yazımızda, farklı genomik testlerin karşılaştırmasını ise lobüler meme kanserinde genomik nüks skoru testleri yazımızda ele aldık.
2. Kronik miyeloid lösemide yanıt ölçümü: BCR-ABL1
Kronik miyeloid lösemi, onkolojide PCR'ın en derin biçimde yerleştiği hastalıktır. Hastalığın sürücüsü olan BCR-ABL1 füzyon transkripti, niceliksel RT-PCR ile ölçülür ve sonuç Uluslararası Ölçek (International Scale, IS) üzerinden raporlanır. Tedavi başarısı burada "tümör küçüldü mü" ile değil, bir sayının kaç logaritma düştüğüyle tanımlanır.
| Düzey | Tanım | Anlamı |
|---|---|---|
| %1 IS | BCR-ABL1 ≤ %1 | Tam sitogenetik yanıt eşdeğeri |
| MMR / MR3 | BCR-ABL1 ≤ %0,1 | Başlangıca göre 3 log azalma — majör moleküler yanıt |
| MR4 | ≤ %0,01 veya >10.000 ABL1 transkripti ile saptanamaz | 4 log azalma |
| MR4.5 | ≤ %0,0032 veya >32.000 ABL1 transkripti ile saptanamaz | 4,5 log azalma |
| MR5 | ≤ %0,001, >100.000 ABL1 transkripti ile | 5 log azalma |
Yanıt kilometre taşları genellikle 3., 6. ve 12. aylarda değerlendirilir. Tanımların içindeki transkript sayıları testin duyarlılık şartıdır: MR4.5 raporlayabilmek için laboratuvarın en az 32.000 kontrol transkripti çoğaltmış olması gerekir.
Bu tablo, PCR'ın ulaştığı hassasiyetin en çarpıcı göstergesidir. Onbinde üçlük bir oranı güvenilir biçimde ölçmek, milyonda birkaç molekülü saymak demektir — ve bu ölçüm her üç ayda bir, rutin bir hastane laboratuvarında yapılmaktadır. Derin ve sürdürülen moleküler yanıt, bazı hastalarda tirozin kinaz inhibitörünü kesme denemesinin (tedavisiz remisyon) gündeme gelmesini sağlar. Ancak kesme denemesi için gereken yanıt derinliği ve süresi bu yazı için doğrulanamamıştır; bu karar hematologa aittir ve burada sayısal bir eşik verilmemektedir.
3. Rahim ağzı kanseri taramasında HPV testi
Rahim ağzı kanseri taraması, son yirmi yılda hücreye bakmaktan (sitoloji/smear) virüsün nükleik asidine bakmaya geçti. Amerikan Kanser Derneği'nin 2020 kılavuzu bunu açıkça yazar: "25 yaşından 65 yaşına kadar, beş yılda bir yapılan primer HPV testinin (Pap testi olmadan HPV testi) tercih edilen yöntem olması" önerilir; birlikte test (co-testing) ve tek başına sitoloji ise "kabul edilebilir alternatifler" olarak, primer tarama için onaylı HPV testine erişimin her yerde mümkün olmayabileceği gerekçesiyle korunur.
Bu alanda ayrım yapmak gerekir: tüm HPV testleri PCR değildir. Aptima HPV testi, virüsün DNA'sını değil E6/E7 mRNA'sını saptar ve farklı bir çoğaltma kimyası kullanır. Bu ayrım önemsiz değildir — mRNA saptamak, virüsün yalnızca varlığını değil, onkogenlerinin etkin olduğunu gösterme iddiasındadır.
Yeni gelişme: kendi kendine örnek alma. FDA, 14 Mayıs 2024'te iki HPV testi için — BD Onclarity HPV ve Roche cobas HPV — kadının örneği kendisinin almasına onay verdi. Onay, örneğin "birinci basamak muayenehaneleri, acil bakım merkezleri, eczaneler ve mobil klinikler gibi bir sağlık ortamında" alınmasını kapsıyor. Bu, jinekolojik muayeneden çekindiği için taramaya hiç girmeyen kadınlar açısından önemli bir eşiktir. Rahim ağzı kanserinin tarama ile önlenebilirliğini serviks kanseri yazımızda ayrıntılı ele almıştık.
4. Glioblastomda tedavi yanıtı öngörüsü: MGMT metilasyonu
Glioblastomda MGMT gen promotörünün metile olup olmadığı, temozolomid kemoterapisinden fayda görme olasılığını öngörür. Bu durumu saptamanın başlıca yöntemi metilasyona özgü PCR (methylation-specific PCR, MSP), ikinci yöntem ise pirodizilemedir (pyrosequencing, PSQ).
Neuro-Oncology dergisinde yayımlanan Cochrane temelli meta-analiz, yöntemin ne kadar baskın olduğunu sayıyla gösteriyor: tek teknik kullanan yaklaşık 190 çalışmada (27.710 katılımcı) 94 çalışma MSP, 27 çalışma pirodizileme kullanmıştı. Temozolomid alan glioblastom hastalarında öngörü gücü karşılaştırıldığında, immünohistokimyaya göre MSP'nin tehlike oranı oranı (RHR) 1,31 (%95 GA 1,01–1,71), pirodizilemenin 1,36 (1,01–1,84) bulundu; pirodizileme ile MSP arasındaki fark ise anlamlı değildi (1,14; 0,87–1,48). Eşik değer konusunda ise CpG 74–78 bölgeleri için %9'luk eşiğin, %28–29'luk daha yüksek eşiklerden daha iyi çalıştığı bildirildi.
Bu son cümle, moleküler testlerin az konuşulan yanını gösteriyor: aynı yöntemle aynı örneğe bakıp farklı eşik kullanan iki laboratuvar, aynı hastaya farklı sonuç verebilir. "MGMT metile" demek, hangi yöntemle ve hangi eşikle metile olduğunu bilmeden eksik bir cümledir. Glioblastomda moleküler tanının tedaviyi nasıl belirlediğini glioblastom moleküler tanı ve IDH-vahşi tip yüksek dereceli gliom yazılarımızda ele aldık.
PCR temelli eşlik eden tanı testleri (companion diagnostics)
FDA'nın resmî eşlik eden tanı testi listesinde, bir ilacın etiketinde adı geçen ve o ilacı kimin alacağına karar veren çok sayıda PCR testi bulunur. Aşağıdakiler doğrudan bu listeden alınmıştır.
| Test | Üretici | PMA no | Eşlik ettiği ilaç(lar) |
|---|---|---|---|
| cobas EGFR Mutation Test v2 | Roche Molecular Systems | P120019 | Osimertinib, erlotinib, gefitinib, afatinib |
| therascreen KRAS RGQ PCR Kit | QIAGEN | P140022 | Setuksimab, panitumumab |
| cobas KRAS Mutation Test | Roche Molecular Systems | P140023 | Setuksimab, panitumumab |
| therascreen PIK3CA RGQ PCR Kit | QIAGEN | P180001 | Alpelisib |
| cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test | Roche Molecular Systems | P110020 | Vemurafenib; sonradan kobimetinib |
| therascreen BRAF | QIAGEN | P130010 | Vemurafenib |
Üretici, PMA numarası ve eşlik ettiği ilaç bilgileri FDA'nın eşlik eden tanı testleri listesinden alınmıştır. Onay yılları bu yazı için tek tek doğrulanamadığından tabloya konmamıştır — her testin tarihi accessdata.fda.gov üzerinden PMA numarasıyla kontrol edilebilir.
Bu tablo, PCR'ın onkolojideki rolünü tek bakışta özetler: akciğer kanserinde hangi hastanın EGFR inhibitörü alacağı, kolorektal kanserde hangi hastaya anti-EGFR antikor verilmeyeceği, melanomda hangi hastanın BRAF inhibitörüne uygun olduğu — hepsi bir PCR sonucuna bağlıdır. Karsinomun türünü belirleyen patoloji raporu artık tek başına yeterli değildir; yanında moleküler rapor gelir.
Sıvı biyopsi ve minimal kalıntı hastalık: PCR'ın devri kapanıyor mu?
Kanda dolaşan tümör DNA'sını (ctDNA) ölçerek ameliyat sonrası mikroskobik hastalık kalıp kalmadığını anlamak — yani minimal kalıntı hastalık (MRD) takibi — onkolojinin en hızlı büyüyen alanlarından biri. Dijital PCR'ın nadir varyant duyarlılığı düşünüldüğünde bu alanın PCR'ın doğal hâkimiyet sahası olması beklenirdi. Gerçek daha karışık.
Bir yaygın yanlışı düzeltmek gerekiyor. Sık kullanılan tümör-bilgili MRD testlerinden Signatera, çoğu zaman "kişiye özel multipleks PCR" olarak tarif edilir. Üreticinin güncel hekim sayfası ise testi şöyle tanımlıyor: tümör dokusunun tüm ekzom veya tüm genom dizilemesiyle kişiye özel bir panel kurulur, 64 klonal varyant seçilir ve bunlar kanda "her seçilmiş varyant için 350.000 kata kadar derinlikte ultra-derin dizileme" ile aranır. Yani okuma adımı dizilemedir, PCR değildir. Aynı sayfa testin FDA tarafından onaylanmadığını ("have not been cleared or approved by the US Food and Drug Administration") açıkça belirtir; laboratuvar CLIA ve CAP akreditasyonlu olarak çalışır ve test, hastalık ilerlemesi, nüks ve relaps takibi için Medicare kapsamındadır.
Buradan çıkan sonuç, PCR'ın gerilediği değil, işbölümünün değiştiğidir. Tümörde hangi mutasyonların olduğunu bilmediğiniz zaman dizileme gerekir — çünkü PCR yalnızca aradığınız şeyi bulur. Ama hangi mutasyonu aradığınızı bildiğiniz zaman, PCR daha hızlı, daha ucuz ve çoğu zaman yeterince duyarlıdır. ctDNA rehberliğinde tedavi değiştirmenin klinik karşılığını GALAXY çalışması ve SERENA-6'da ESR1 mutasyonuna göre tedavi değişimi yazılarımızda; kan testiyle tarama tarafını ise fragmentomik ve metilasyon temelli kolon kanseri taraması yazımızda ele aldık.
PCR mı, yeni nesil dizileme mi?
Bu soru sık sorulur ve genellikle yanlış kurulur. İkisi rakip değil, farklı soruların araçlarıdır. Ulusal Kanser Enstitüsü'nün ifadesiyle, biyobelirteç testlerinin bir kısmı "tek bir biyobelirtece bakar", bir kısmı ise "aynı anda birçok biyobelirtece bakar ve çok genli veya panel testler olarak adlandırılabilir"; bazıları ise tüm ekzomu ya da tüm genomu okur.
| PCR temelli test | Yeni nesil dizileme (NGS) | |
|---|---|---|
| Temel mantık | Aradığını bulur | Ne olduğunu okur |
| Hedef | Önceden tanımlı, sınırlı sayıda varyant | Geniş panel, ekzom veya genom |
| Bilinmeyen varyant | Göremez — primer tasarlanmamıştır | Görebilir |
| Düzenleyici konum | İlaç etiketinde adı geçen eşlik eden tanı testi olabilir | Geniş panel onayları da vardır |
| Tipik kullanım | Tek bir kararı vermek | Haritayı çıkarmak |
Not: Bu tabloda kasıtlı olarak süre, maliyet ve duyarlılık karşılaştırması verilmemiştir. Bu konularda yaygın biçimde dolaşan sayılar için bu yazı hazırlanırken otoriter bir kaynak doğrulanamamıştır; tahmin yürütmek yerine boş bırakılmıştır.
Yapısal argüman şudur: FDA, tek varyanta bakan PCR testlerini bugün de eşlik eden tanı testi olarak onaylamaya devam ediyor ve bu testlerin adı ilaç etiketlerinde geçiyor. Eğer dizileme PCR'ın yerini tamamen alsaydı, bu listenin PCR satırları boşalırdı. Boşalmıyor. Mutasyon haritası çıkarmak için dizileme, bilinen bir mutasyona dayalı bir kararı vermek için PCR — ikisi birlikte çalışıyor. Mutasyonun genin neresinde olduğunun önemini gösteren çalışmalar da tam olarak bu iki katmanlı yaklaşımın ürünüdür.
PCR'ın sınırları ve hata kaynakları
Hiçbir yöntem kendi sınırlarını bilmeden doğru kullanılamaz. PCR'ın klinikte en sık karşılaşılan sorunları şunlardır:
PCR'ın gücü zayıflığıdır: tek bir molekül bile çoğaltılabildiği için, önceki bir reaksiyondan havaya karışan ürün yanlış pozitif verebilir. Moleküler laboratuvarlarda ayrı odalar ve tek yönlü iş akışı bu yüzden zorunludur.
Kandaki hemoglobin, dokudaki formalin kalıntısı veya heparin enzimi baskılayabilir. Sonuç yanlış negatif olur — ve iç kontrol konmazsa bu fark edilmez.
PCR yalnızca primer tasarladığınız diziyi görür. Panelde olmayan bir mutasyon, "mutasyon yok" olarak raporlanır. Bu, negatif bir sonucun her zaman dikkatle okunması gerektiği anlamına gelir.
Düzeltme aktivitesi olmayan Taq, yaklaşık 9.000 nükleotitte bir hata yapar. Tanı testlerinde önemsizdir, dizileme öncesi çoğaltmada önemlidir.
Parafine gömülü dokularda DNA parçalanmıştır. Uzun hedefler çoğalmaz. Testin başarısızlığı çoğu zaman yöntemin değil, örneğin sorunudur.
PCR diziyi bulur, o dizinin sahibi organizmanın canlı ya da hücrenin aktif olduğunu göstermez. Yorum her zaman klinik bağlamla birlikte yapılır.
PCR'ın kullanım alanları
| Alan | Uygulama |
|---|---|
| Onkoloji | Eşlik eden tanı testleri (EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA) |
| Gen ifade temelli nüks skorları (21 genlik RT-PCR testi) | |
| Hematolojik malignitelerde moleküler yanıt takibi (BCR-ABL1) | |
| Metilasyon durumunun saptanması (MGMT) | |
| Genetik | Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcılık ve tanı |
| Doğum öncesi (prenatal) tanı | |
| Tüp bebekte implantasyon öncesi genetik test | |
| Enfeksiyon | Viral ve bakteriyel patojenlerin saptanması |
| Viral yük ölçümü (HIV, HBV, HCV) | |
| HPV temelli rahim ağzı kanseri taraması | |
| Adli tıp | Kimlik tespiti ve babalık testi |
| Çok az miktarda örnekten DNA profili çıkarma | |
| Araştırma | Klonlama, dizileme öncesi çoğaltma |
| DNA–protein etkileşimlerinin incelenmesi | |
| Evrimsel biyoloji ve eski DNA çalışmaları | |
| Gıda ve endüstri | Tür tayini ve tağşiş denetimi |
| Alerjen ve genetiği değiştirilmiş organizma tespiti |
Türkiye'de durum
Ulusal tarama programında HPV testi
Türkiye'nin Serviks Kanseri Tarama Programı Ulusal Standartları belgesinde tarama şöyle tanımlanır: "kadınlarda 30 yaşında başlayan ve 65 yaşında biten toplum tabanlı taramadır" ve "ideal yöntem beş yılda bir uygulanacak HPV testi veya Pap-smear testi ile taramadır". Test "HPV veya Pap-smear testi her beş yılda bir tekrarlanır" ifadesiyle beş yıllık aralığa bağlanmıştır.
Örnek alma işi, "ASM'nde veya TSM'nde (KETEM) görevli, bu konuda eğitim almış sağlık personeli" tarafından yapılır; alınan örnekler "Türkiye Halk Sağlığı Kurumu veya Halk Sağlığı Müdürlüklerince belirlenen merkezlere inceleme için uygun tespit koşullarında" gönderilir. Yani program, merkezî laboratuvar yapısı üzerine kurulmuştur — ki HPV testinin toplum tabanlı uygulanmasının teknik ön koşulu budur.
Bu belgenin güncel sürümü, programın bugünkü işleyişi, kullanılan test markaları ve kapsama oranları bu yazı için doğrulanamamıştır. Elimizdeki metin programın standartlarını tanımlayan resmî belgedir; güncel uygulama ayrıntıları için Sağlık Bakanlığı'nın kendi kaynaklarına başvurulmalıdır. Ülkemizdeki kanser yükünün genel tablosu için Türkiye kanser istatistikleri yazımıza bakabilirsiniz.
Moleküler patoloji ve geri ödeme
Bu yazıda SGK geri ödemesine ilişkin hiçbir iddiada bulunulmamaktadır. Oncotype DX gibi gen ifade temelli nüks skoru testlerinin, PCR temelli eşlik eden tanı testlerinin veya ctDNA/MRD testlerinin Türkiye'de geri ödeme kapsamında olup olmadığı bu yazı için doğrulanamamıştır. Bu konuda dolaşan kesin ifadelere temkinli yaklaşmak gerekir; güncel durum tedavi eden hekim ve ilgili kurum üzerinden teyit edilmelidir. Yeni ilaçlara ve testlere erişimin genel görünümünü FDA onaylı yeni kanser ilaçları Türkiye erişim haritası yazımızda ele aldık.
Pratik bir not: EGFR, KRAS, BRAF gibi mutasyon testleri Türkiye'de üniversite hastaneleri, eğitim-araştırma hastaneleri ve özel moleküler patoloji laboratuvarlarında yaygın biçimde çalışılmaktadır. Hasta açısından önemli olan testin yapılıp yapılmadığı kadar, hangi yöntemle ve hangi kapsamda yapıldığıdır: "KRAS mutasyonu saptanmadı" raporu, panelde hangi kodonların bulunduğu bilinmeden tam olarak yorumlanamaz.
Zaman çizelgesi
DROZDOGAN Akademi Yorumu
PCR'ın hikâyesi, tıpta iyi bir fikrin nasıl yayıldığını anlatan en temiz örneklerden biri. Ama bu yazıyı güncellerken asıl dikkat çeken şey, yöntemin kendisi kadar, hakkında anlatılanların da kontrol edilmeye muhtaç olması oldu.
⚡ Neden önemli
Çünkü PCR onkolojide artık bir arka plan teknolojisi değil, karar noktası. 21 genlik bir RT-PCR sonucu binlerce kadının kemoterapi almamasını sağlıyor. Bir BCR-ABL1 ölçümü hastanın tedaviye devam edip etmeyeceğini belirliyor. Bir EGFR testi hangi ilacın verileceğine karar veriyor. Hasta için bu şu demek: "testin sonucu çıkmadı" cümlesi, "tedaviye başlayamıyoruz" cümlesiyle aynı şeydir. PCR'ın ne olduğunu bilmek, kendi tedavi sürecini anlamanın parçasıdır.
✅ Güçlü olan taraf
PCR'ın kırk yıldır ayakta kalmasının nedeni zarafeti değil, tekrarlanabilirliği. Aynı örnek, aynı primerler, aynı protokol — dünyanın herhangi bir yerinde aynı sonuç. Kronik miyeloid lösemide onbinde üçlük bir oranın Uluslararası Ölçek üzerinden raporlanabilmesi, bu standardizasyonun somut kanıtı: Ankara'daki laboratuvarla Boston'daki laboratuvarın sayısı karşılaştırılabiliyor. Onkolojide bu kadar iyi standardize edilmiş ölçüm azdır.
⚠️ Zayıf olan taraf
PCR yalnızca aradığınız şeyi bulur. Bu, negatif sonuçların en yanıltıcı yanıdır: "mutasyon saptanmadı" raporu, çoğu zaman "panelimizdeki mutasyonlar saptanmadı" demektir ve bu ikisi aynı şey değildir. MGMT örneğinde gördüğümüz gibi, aynı yöntemle çalışan iki laboratuvar farklı eşik kullanarak aynı hastaya farklı sonuç verebilir. Bir de kontaminasyon sorunu var: tek molekülü çoğaltabilen bir yöntem, havaya karışmış tek bir molekülü de çoğaltır. PCR'ın hassasiyeti, aynı zamanda kırılganlığıdır.
🩺 Hastaya ne söylemeli
(1) Moleküler test istendiğinde, sonucun birkaç gün ile birkaç hafta arasında sürebileceğini ve bu beklemenin genellikle doğru tedaviyi seçmek için gerekli olduğunu anlatın. (2) Raporu birlikte okuyun: hangi genlere bakıldığını ve hangi yöntemle bakıldığını gösterin. (3) "Negatif" sonucun mutlak olmadığını, panelin kapsamına bağlı olduğunu söyleyin. (4) Doku yetersizse testin tekrarlanması veya kan örneğiyle çalışılması gerekebileceğini baştan belirtin — bu, sonradan gelen gecikmelerin en sık nedenidir. (5) İnternette "PCR testleri güvenilmez" iddialarıyla karşılaşacaklarını ve bunların kaynağının çoğunlukla yöntemle ilgili olmadığını hatırlatın.
❓ Açık sorular
Tümör-bilgili MRD testleri dizilemeye kaydı; dijital PCR bu alanda daha ucuz ve daha hızlı bir alternatif olarak geri dönebilir mi? İkincisi: ctDNA pozitifliği saptanan ama görüntülemede hiçbir şey görünmeyen hastada tedaviyi erken başlatmak sağkalımı gerçekten uzatıyor mu — yoksa yalnızca nüksü daha erken mi öğreniyoruz? Bu, MRD alanının cevaplanmamış temel sorusudur. Üçüncüsü: gen ifade temelli nüks skorları menopoz durumuna göre neden tersine dönüyor — kemoterapinin kendisi mi işe yarıyor, yoksa yol açtığı menopoz mu?
Sonuç: PCR, kırk yıl sonra hâlâ yerini koruyor — ama artık tek başına değil, dizilemeyle işbölümü içinde. Onkolojide kullanımı genişledikçe, yöntemin kendisinden çok raporunun nasıl okunduğu önem kazanıyor. Bu yazının güncellemesinde en çok emek isteyen kısım da yeni bilgiyi eklemek değil, eski bilginin yanlış olan kısmını ayıklamak oldu: sekiz yaygın ifadenin sekizi de düzeltme gerektirdi. Bilgi eskimez sanılır; oysa en çok tekrarlanan bilgiler en hızlı eskiyenlerdir.
Sık sorulan sorular
- PCR testi ne kadar sürede sonuçlanır?
- Reaksiyonun kendisi genellikle 1–3 saat sürer. Ancak klinik bir sonuç için gereken toplam süre çok daha uzundur: örneğin alınması, laboratuvara ulaşması, DNA/RNA çıkarılması, reaksiyon, yorumlama ve raporlama. Onkolojide doku bazlı moleküler testlerin sonucu genellikle günler-haftalar içinde çıkar. Bu süre yöntemin yavaşlığından değil, sürecin bütününden kaynaklanır.
- "Mutasyon saptanmadı" ne demek?
- Test edilen panelde bulunan mutasyonların saptanmadığı anlamına gelir — hiçbir mutasyon olmadığı anlamına gelmez. PCR yalnızca primer tasarlanmış dizileri görür. Raporda hangi gen bölgelerinin incelendiği yazmalıdır; yazmıyorsa sorulmalıdır.
- PCR ile yeni nesil dizileme arasındaki fark nedir?
- PCR aradığını bulur, dizileme ne olduğunu okur. Bilinen tek bir mutasyona dayalı bir karar verilecekse PCR; tümörün moleküler haritası çıkarılacaksa dizileme uygundur. İkisi rakip değil, tamamlayıcıdır — FDA bugün de tek varyanta bakan PCR testlerini eşlik eden tanı testi olarak onaylamaktadır.
- Ct değeri düşükse hastalık ağır mı demektir?
- Ct, başlangıçtaki hedef miktarıyla ters orantılıdır: düşük Ct, çok hedef demektir. Ancak Ct göreli bir sayıdır ve cihaza, kite, örnek alma tekniğine göre değişir. Farklı laboratuvarların Ct değerleri doğrudan karşılaştırılamaz ve Ct tek başına hastalık şiddetinin ölçüsü değildir.
- Kanser tanısı PCR ile konur mu?
- Hayır. Kanser tanısı patolojik incelemeyle konur — dokunun mikroskopta değerlendirilmesiyle. PCR, tanı konduktan sonra tümörün moleküler özelliklerini belirlemek, tedaviyi seçmek ve yanıtı izlemek için kullanılır. İstisna, HPV taraması gibi kanser öncüsü durumları yakalamaya yönelik tarama uygulamalarıdır — orada da kesin tanı yine patolojiyle konur.
- Kan testiyle kanser saptanabiliyor mu?
- Kanda dolaşan tümör DNA'sı (ctDNA) saptanabiliyor ve bu alan hızla gelişiyor. Ancak bugünkü kullanımın ağırlığı tarama değil, tanı konmuş hastada tedavi seçimi ve nüks takibidir. Tümör-bilgili takip testlerinin önemli kısmı artık PCR değil dizileme temellidir ve bunların bir kısmı FDA onaylı değil, laboratuvar geliştirmiş test olarak çalışır.
- PCR testi yanlış sonuç verebilir mi?
- Evet. Yanlış pozitifin başlıca kaynağı kontaminasyondur — PCR tek bir molekülü bile çoğaltabildiği için havaya karışmış ürün sorun yaratır. Yanlış negatifin başlıca kaynakları ise inhibisyon (kan, formalin, heparin), örnekteki DNA'nın parçalanmış olması ve aranan varyantın panelde bulunmamasıdır. Bu nedenle iyi bir test iç kontrol içerir.
- PCR'ı kim buldu, tek kişi mi?
- Fikir Kary Mullis'e aittir ve 1993 Nobel Kimya Ödülü bu gerekçeyle ona verilmiştir. Ancak yöntemi çalışır hâle getiren, ilk kez bir hastalıkta uygulayan ve otomasyonu sağlayan çalışmalar Cetus Corporation'daki geniş bir ekibin ürünüdür — 1985 tarihli ilk makalenin yedi yazarı vardır ve ilk yazarı Randall Saiki'dir.
- Türkiye'de HPV taraması yapılıyor mu?
- Ulusal tarama standartları, 30–65 yaş arası kadınlarda beş yılda bir HPV testi veya Pap-smear ile toplum tabanlı tarama tanımlar. Örnek alma ASM veya KETEM'de eğitimli sağlık personelince yapılır, örnekler belirlenen merkezlere gönderilir. Programın güncel işleyiş ayrıntıları ve kapsama oranları bu yazı için doğrulanamamıştır.
- Bu testler Türkiye'de geri ödeniyor mu?
- Bu yazıda geri ödeme konusunda hiçbir iddiada bulunulmamaktadır — Oncotype DX benzeri gen ifade testlerinin, PCR temelli eşlik eden tanı testlerinin ve ctDNA testlerinin SGK kapsamındaki durumu doğrulanamamıştır. Güncel bilgi tedavi eden hekim ve ilgili kurum üzerinden teyit edilmelidir.
Sözlük
- Primer
- Hedef DNA dizisinin iki ucuna bağlanan, genellikle 18–25 nükleotitlik sentetik DNA parçası. Çoğaltılacak bölgeyi sınırlandırır.
- Tm (erime sıcaklığı)
- Bir primerin hedefinin yarısından ayrıldığı sıcaklık. Bağlanma sıcaklığı bunun 3–5 °C altına ayarlanır.
- Denatürasyon
- Çift sarmallı DNA'nın ısıyla iki tek zincire ayrılması.
- Taq polimeraz
- Thermus aquaticus'tan elde edilen ısıya dayanıklı DNA polimeraz. Optimum 75–80 °C; 3'→5' düzeltme aktivitesi yoktur.
- Termal döngü cihazı
- PCR tüpünün sıcaklığını programlanmış sırayla değiştiren cihaz.
- RT-PCR
- Ters transkripsiyon PCR. RNA önce cDNA'ya çevrilir, sonra çoğaltılır.
- qPCR / gerçek zamanlı PCR
- Çoğalmanın her döngüde floresan ölçümüyle izlendiği PCR. Niceliksel sonuç verir.
- Ct / Cq
- Floresan sinyalinin eşiği geçtiği döngü numarası. Düşük değer, başlangıçta çok hedef demektir.
- TaqMan probu
- Bir ucunda ışıyan molekül, diğer ucunda söndürücü taşıyan prob. Polimeraz tarafından parçalanınca ışık açığa çıkar.
- Dijital PCR (dPCR/ddPCR)
- Örneğin binlerce bölmeye ayrılıp pozitif bölmelerin sayıldığı yöntem. Standart eğri olmadan mutlak sayım yapar.
- Eşlik eden tanı testi
- Bir ilacın etiketinde adı geçen ve o ilacın kime verileceğini belirleyen onaylı test.
- ctDNA
- Kanda dolaşan tümör kaynaklı DNA. Tüm serbest DNA içindeki payı çoğu zaman çok düşüktür.
- Minimal kalıntı hastalık (MRD)
- Tedavi sonrası görüntülemeyle saptanamayan, ancak moleküler yöntemlerle gösterilebilen mikroskobik hastalık.
- Uluslararası Ölçek (IS)
- BCR-ABL1 ölçümlerinin laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilmesi için kullanılan standardize raporlama ölçeği.
- Metilasyona özgü PCR (MSP)
- DNA'nın metillenmiş ve metillenmemiş hâllerini ayırt edecek biçimde tasarlanmış primerlerle yapılan PCR.
- Kontaminasyon
- Önceki reaksiyonlardan veya çevreden gelen DNA'nın örneğe karışması. PCR'da yanlış pozitifin başlıca nedenidir.
Şeffaflık notu.
Doğrulananlar: 1985 Science makalesinin tam yazar listesi, cilt ve sayfa bilgisi; Mullis ve Faloona'nın 1987 Methods in Enzymology makalesi; 1968 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nün sahipleri ve gerekçesi; Khorana'nın 1972 gen sentezi; Kornberg'in 1956 keşfi ve 1959 Nobel'i; Thermus aquaticus'un 1969'da Brock ve Freeze tarafından Yellowstone'da bulunduğu; Taq polimerazın 1976'da Chien, Edgar ve Trela tarafından saflaştırıldığı ve optimum sıcaklığı; Taq'ın 95 °C'deki yarı ömrü ve hata oranı; Mullis'in Nobel dersinde Science reddini kendisinin anlatması; 1988 Science Taq makalesi; "Mr. Cycle" ve TC1 DNA Thermal Cycler; 1993 Nobel Kimya Ödülü'nün paylaşımı ve gerekçeleri; Mullis'in HIV-AIDS, iklim ve astroloji konusundaki görüşleri ile vefat tarihi ve yaşı; 1992 Higuchi çalışması; dijital PCR teriminin 1999'da Vogelstein ve Kinzler tarafından ortaya atılması ve bildirilen duyarlılık değerleri; klinik ddPCR sisteminin 2017 CE ve 2019 FDA onayı; Oncotype DX'in 21 gen / 16+5 yapısı ve RT-PCR yöntemi (üretici sayfası); TAILORx ve RxPONDER sonuçları (NCI ve SWOG duyuruları); BCR-ABL1 moleküler yanıt tanımları; FDA'nın 14 Mayıs 2024 tarihli HPV kendi kendine örnek alma onayı; Aptima'nın E6/E7 mRNA testi olduğu; ACS 2020 tarama önerisi; MGMT meta-analizi verileri; FDA eşlik eden tanı testi listesindeki üretici, PMA ve ilaç eşleşmeleri; Signatera'nın üretici tarafından tanımlanan yöntemi ve düzenleyici durumu; Türkiye serviks tarama standartlarının metni.
Doğrulanamayanlar: Genetik kodun çözülme yıllarının (1961, 1966) birincil kaynağı; Kornberg'in 1956 çalışmasındaki ortak yazarlar ve kaynak organizmanın açık teyidi; "Mr. Cycle"ı yapan mühendislerin adları; TaqMan kimyasını geliştirenler ve ilk ticari gerçek zamanlı cihazın tarihi; Higuchi'nin 1992'deki kurumu; LAMP yönteminin geliştiricisi ve yılı (bu nedenle yazıda LAMP'a yer verilmemiştir); salgın sırasında dünyada yapılan toplam test sayısı; FDA onaylı PCR testlerinin toplam sayısı; eşlik eden tanı testlerinin onay yılları (bu nedenle tabloya konmamıştır); kronik miyeloid lösemide tedavi kesme denemesi için gereken yanıt derinliği ve süresi; cobas HPV testinin gerçek zamanlı PCR olduğunun birincil kaynaktan teyidi; PCR ile yeni nesil dizilemenin süre, maliyet ve duyarlılık karşılaştırmasına ilişkin otoriter sayılar; glioblastomda MGMT durumuna göre sağkalım rakamları; Türkiye'de serviks tarama programının güncel işleyişi, kullanılan test markaları ve kapsama oranları; SGK geri ödeme durumu (hiçbir iddiada bulunulmamıştır).
Düzeltmelerin niteliği: Yazıdaki sekiz maddelik düzeltme tablosu, bu yazının önceki sürümünde ve yaygın Türkçe kaynaklarda bulunan ifadelerin birincil ve ikincil kaynaklarla karşılaştırılmasından çıkmıştır. "15 dergi reddetti" ifadesinin desteklenmediği sonucu bize aittir: bu iddiayı destekleyen güvenilir bir kaynak bulunamamış, buna karşılık iki red (Nature ve Science) belgelenmiştir. Mullis'in bilimsel yöntemiyle kişisel görüşlerinin ayrılması gerektiği değerlendirmesi de bu yazıya aittir.
Çıkar beyanı: Bu yazıda adı geçen hiçbir test, cihaz veya üretici firma ile bağlantımız yoktur.
Kaynaklar
- Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. "Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia." Science 1985;230(4732):1350–1354.
- Mullis KB, Faloona FA. "Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction." Methods in Enzymology 1987;155:335–350.
- Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase." Science 1988;239(4839):487–491.
- Chien A, Edgar DB, Trela JM. "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus." Journal of Bacteriology 1976;127(3):1550–1557.
- The Nobel Prize in Chemistry 1993 — Kary B. Mullis ve Michael Smith. nobelprize.org
- Mullis KB. Nobel Lecture, 8 Aralık 1993. nobelprize.org
- The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1968 — Holley, Khorana, Nirenberg. nobelprize.org
- The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959 — Ochoa, Kornberg. nobelprize.org
- Higuchi R, ve ark. "Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences." Bio/Technology 1992.
- Vogelstein B, Kinzler KW. Dijital PCR kavramının tanımlanması, 1999.
- National Cancer Institute. "TAILORx trial: chemotherapy not beneficial for many women with early breast cancer." Basın bülteni, 2018. cancer.gov
- SWOG Cancer Research Network. RxPONDER sonuçlarının NEJM'de yayımlanmasına ilişkin duyuru, 3 Aralık 2021. swog.org
- Exact Sciences. Oncotype DX Breast Recurrence Score — sağlık profesyonelleri sayfası. exactsciences.com
- U.S. Food and Drug Administration. "List of Cleared or Approved Companion Diagnostic Devices (In Vitro and Imaging Tools)." fda.gov
- National Cancer Institute. "FDA approves self-collection for HPV tests." Cancer Currents Blog, 2024. cancer.gov
- American Cancer Society. Serviks kanseri tarama kılavuzu, 2020. pressroom.cancer.org
- Hologic. Aptima HPV testi ürün bilgisi — E6/E7 mRNA. hologic.com
- MGMT promotör metilasyonu yöntemlerinin karşılaştırmalı meta-analizi. Neuro-Oncology 2021;23(9):1457.
- Natera. Signatera — klinisyen bilgi sayfası. natera.com
- National Cancer Institute. "Biomarker Testing for Cancer Treatment." cancer.gov
- T.C. Sağlık Bakanlığı. Serviks Kanseri Tarama Programı Ulusal Standartları.
- Brock TD, Freeze H. Thermus aquaticus'un izolasyonu, 1969.
