De ce este virusul Delta atât de periculos? Cum infectează coronavirusul celulele?

Ca un lup în blană de oaie, multe virusuri au glicani pentru a se camufla față de sistemul imunitar uman, acoperindu-și proteinele externe. Rommie Amaro, specialistă în chimie biofizică computațională la Universitatea California din San Diego, și colegii săi au realizat, pe baza datelor structurale și genetice, cea mai detaliată vizualizare de până acum a acestui înveliș care acoperă virusul. Cu ajutorul unui supercomputer, echipa a construit imaginea atom cu atom.

La simularea publicată pe Twitter la 22 martie 2020, un cercetător a comentat în decurs de o oră: ce este bucla goală, neacoperită, care iese din partea superioară a proteinei?

Amaro nu avea un răspuns la această întrebare. Totuși, la 10 minute după comentariu, biologul structural Jason McLellan de la Universitatea Texas din Austin a explicat că bucla neacoperită se leagă de receptorii de pe celulele umane și reprezintă un domeniu de legare de receptor (RBD= receptor binding domain), una dintre cele trei părți ale proteinei spike (țepușă).

Sursa imaginii: Structural image from Lorenzo Casalino, Univ. California, San Diego; Graphic: Nik Spencer/Nature

În simularea lui Amaro, RBD se ridică deasupra norului de glicani, iar doi glicani îl țin în poziție, asemenea unui cric de sprijin al bicicletei. Când Amaro a produs în glicanii modelului computerizat o mutație, RBD s-a prăbușit. McLellan și echipa sa au dezvoltat o modalitate de a efectua același experiment în laborator și, până în iunie 2020, au raportat că mutarea celor doi glicani reduce capacitatea proteinei spike de a se lega de un receptor celular uman. McLellan spune că acesta este un rol despre care nimeni nu știa anterior în cazul coronavirusurilor. Deși cercetătorii nu au încă o modalitate de a reduce cele două zaharuri, Amaro sugerează că realizarea acestui lucru ar putea diminua contagiozitatea virusului.

De la începutul pandemiei de Covid-19, oamenii de știință dezvoltă o înțelegere detaliată a modului în care SARS-CoV-2 infectează celulele. Pe lângă procesul infecției, doresc să găsească modalități mai bune de a-l opri prin tratamente și vaccinuri îmbunătățite și să afle de ce noile variante, precum Delta, sunt mai contagioase.

Cum infectează coronavirusul celulele?

Ceea ce a rezultat din 19 luni de cercetare, sprijinită de studiile asupra coronavirusurilor desfășurate de mulți ani, este o descriere detaliată a modului în care SARS-CoV-2 invadează celulele umane. Oamenii de știință au descoperit adaptări importante care ajută virusul să se atașeze cu o forță surprinzătoare de celulele umane și apoi să se ascundă în interior. La ieșirea din celule, SARS-CoV-2 desfășoară un proces foarte important pentru a-și pregăti particulele să infecteze mai multe celule umane. Acestea sunt unele dintre mijloacele care permit virusului să se răspândească atât de rapid și să provoace milioane de decese. Virologa Wendy Barclay de la Imperial College din Londra spune despre aceasta: "De aceea este atât de greu de controlat".

Sursa imaginii: Hui (Ann) Liu, Univ. Utah; Graphic: Nik Spencer/Nature

Cu proteine spike și pregătit să infecteze

Fiecare virion SARS-CoV-2 (particulă virală) are o suprafață externă acoperită cu 24 – 40 de proteine spike dispuse aleatoriu, esențiale pentru fuziunea cu celulele umane. La alte tipuri de virusuri, precum cel gripal, proteinele de fuziune sunt relativ rigide. Însă, potrivit studiului publicat în august 2020 de Martin Beck și colegii săi de la Institutul de Biofizică Mac Planck din Frankfurt, Germania, proteinele spike ale SARS-CoV-2 sunt incredibil de flexibile și articulate în trei puncte.

Acest lucru le permite proteinelor spike să se rotească, să se balanseze și să se răsucească, facilitând scanarea suprafeței celulei și legarea mai multor proteine spike de o celulă umană. Beck a spus că nu există date experimentale similare pentru alte coronavirusuri, însă ar fi rezonabil să presupunem că „această caracteristică este comună, deoarece secvențele proteinelor spike sunt foarte bine conservate evolutiv”.

Sursa imaginii: imagini de crio-tomografie electronică ale SARS-CoV-2 (Scale bar: 30 nanometres.) Credit: B. Turoňová et al./Science

La începutul pandemiei, cercetătorii au confirmat că domeniile RBD ale proteinelor spike SARS-CoV-2 se leagă de o proteină cunoscută, numită receptor ACE2, prezentă în membranele majorității celulelor umane din gât și plămâni. Acest receptor este și punctul de atașare al virusului SARS-CoV, care provoacă sindromul respirator acut sever (SARS). Totuși, comparativ cu SARS-CoV, noul coronavirus (SARS-CoV-2) se leagă de receptorul ACE2 de 2-4 ori mai puternic, deoarece numeroase modificări ale RBD stabilizează punctele de legare ale virusului.

Problema variantelor

În ceea ce privește SARS-CoV-2, îngrijorătoarele variante tind să aibă mutații în subunitatea S1 a proteinei spike, care conține domeniile RBD și este responsabilă pentru legarea de receptorul ACE2. (O a doua subunitate spike, S2, activează și fuziunea virală cu celula-gazdă.)

De exemplu, varianta Alfa conține 10 modificări în secvența proteinei spike, care cresc probabilitatea ca domeniile RBD să rămână în poziția „sus”. Biologa structurală Priyamvada Acharya, care studiază mutațiile spike la Institutul Duke pentru Vaccinuri Umane din Carolina de Nord, a spus: „Ajută virusul să avanseze, facilitând intrarea în celule”.

În prezent, răspândita variantă Delta are numeroase mutații în subunitatea S1, dintre care trei în RBD, iar acestea par să îmbunătățească la varianta Delta capacitatea RBD de a se lega mai puternic de ACE2 și de a evita sistemul imunitar.

Intrare limitată

Când proteinele spike ale virusului se leagă de ACE2, alte proteine de pe suprafața celulei-gazdă inițiază procesul care duce la fuziunea membranelor virală și celulară. (Figura-4: intrarea virală)

Sursa: Janet Iwasa, Univ. Utah; Graphic: Nik Spencer/Nature

Virusul SARS-CoV, care provoacă SARS, utilizează una dintre cele două enzime proteaze ale gazdei pentru a intra în celulă: TMPRSS2 (tempress two) sau catepsina. TMPRSS2 este o cale mai rapidă de intrare în celulă, dar SARS-CoV intră de obicei printr-un endozom – o veziculă înconjurată de lipide – care depinde de catepsina L. Proteinele antivirale pot captura virionii numai când aceștia intră în celule pe această cale.

SARS-CoV-2 diferă de SARS-CoV deoarece utilizează eficient TMPRSS2, o enzimă prezentă în cantități mari pe exteriorul celulelor respiratorii. Mai întâi, TMPRSS2 taie o regiune din subunitatea S2 a proteinei spike. Regiunea tăiată expune o serie de aminoacizi hidrofobi care se înglobează rapid în cea mai apropiată membrană – cea a celulei-gazdă. Apoi, proteina spike alungită se pliază asupra ei înseși ca un fermoar și forțează fuziunea membranelor virală și celulară.

Mai jos, o animație a fuziunii SARS-CoV-2 cu celulele. Credit: Janet Iwasa, University of Utah

Virusul își transferă apoi genomul direct în celulă. Potrivit studiului publicat în aprilie de Barclay și colegii săi de la Imperial College, invadând în acest mod, SARS-CoV-2 se transmite mai rapid decât SARS-CoV și poate evita capturarea în endozomi.

Răspunsul la întrebarea de ce nu a funcționat medicamentul antimalaric Plaquenil

Intrarea rapidă a virusului prin utilizarea TMPRSS2 explică de ce medicamentul antimalaric clorochină, în ciuda rezultatelor timpurii promițătoare din laborator, în studiile clinice ca tratament pentru Covid-19, nu a funcționat. S-a dovedit că acestea utilizau celule dependente numai de catepsine pentru intrarea endozomală. Barclay explică: „Când virusul infectează și se multiplică în tractul respirator uman, nu utilizează endozomul. De aceea clorochina, un medicament care perturbă endozomii, nu este eficientă în viața reală”.

Constatarea indică și proteazele ca opțiune terapeutică promițătoare pentru a împiedica utilizarea TMPRSS2, catepsinei L sau a altor proteaze de către un virus pentru a intra în celulele-gazdă. Inhibitorul TMPRSS2 „mesilat de camostat”, aprobat în Japonia pentru tratamentul pancreatitei, a împiedicat intrarea virală în celulele pulmonare, dar în primele studii clinice nu a îmbunătățit rezultatele pacienților.

Stefan Pöhlmann, șeful Unității de Biologie a Infecției de la Centrul German pentru Primate din Göttingen, care a condus cercetările privind legarea ACE2 și calea TMPRRS2, spune: „Din perspectiva mea, ar trebui să avem inhibitori de protează ca antivirale cu spectru larg pentru a combate focare noi de boală și a preveni viitoarele pandemii încă de la început”.

Competiție mortală

Etapele următoare ale infecției sunt și mai obscure. Chimista Janet Iwasa de la Universitatea Utah, care a creat o animație explicativă a ciclului de viață viral, spune: „După intrarea în celulă există mult mai multe cutii negre. Există mai multă incertitudine și ipoteze concurente”.

Coronavirusurile preiau mecanismele celulare în multe moduri. Virologa Noam Stern-Ginossar și echipa sa s-au concentrat pe trei mecanisme prin care SARS-CoV-2 suprimă mediul mRNA al gazdei în propriul avantaj. Stern-Ginossar spune: "Niciunul nu este specific acestui virus, dar combinația, viteza și amploarea efectelor îl fac unic".

• Mai întâi, virusul elimină concurența: când virusul dorește să intre în celula umană, Nsp1, prima proteină a cărei translație este încheiată, preia proteinele gazdei pentru a descompune sistematic toate moleculele mRNA celulare fără etichetă virală. Totuși, când echipa lui Stern-Ginossar a pus aceeași etichetă la capătul unui mRNA al gazdei, a constatat că mRNA nu era descompus.
• În al doilea rând, infecția reduce translația generală a proteinelor din celulă cu 70%. Potrivit studiilor a două echipe diferite de cercetare, Nsp1 este din nou principalul vinovat. De această dată blochează fizic canalul de intrare al ribozomilor, astfel încât mRNA nu poate pătrunde în ribozom. Stern-Ginossar spune că mica parte rămasă din capacitatea de translație este rezervată RNA-urilor virale.
• În cele din urmă, virusul închide sistemul de alarmă al celulei. Acest lucru se produce în diferite moduri, dar echipa lui Stern-Ginossar a identificat un mecanism clar pentru SARS-CoV-2: virusul împiedică ieșirea mRNA celular din nucleu, inclusiv a instrucțiunilor pentru proteinele care ar trebui să avertizeze sistemul imunitar asupra infecției. O a doua echipă a confirmat constatarea și a indicat din nou Nsp1: proteina pare să comprime canalele de ieșire din nucleu, astfel încât nimic nu poate scăpa. Deoarece transcrierile genelor nu ies din nucleu, celulele infectate nu secretă majoritatea interferonilor – interferonii sunt proteine de semnalizare care avertizează sistemul imunitar asupra prezenței unui virus. SARS-CoV-2 este deosebit de eficient în oprirea acestui sistem de alarmă: comparativ cu alte virusuri respiratorii, inclusiv SARS-CoV și virusul sincițial respirator (RSV), infecția SARS-CoV-2 produce niveluri semnificativ mai mici de interferoni. În iunie 2021, cercetătorii au raportat mutații în varianta Alfa care determină o suprimare și mai eficientă a producției de interferon.

Stern-Ginossar spune: „Este clar că SARS-CoV-2 este un virus foarte rapid, cu o capacitate unică de a împiedica sistemul nostru imunitar să recunoască infecția și să o combată în primele etape”. Când sistemul imunitar își dă seama că există un virus, numărul virusurilor este atât de mare încât proteinele răspunsului imunitar trec uneori în circulația sanguină mai rapid decât în mod normal – ceea ce poate fi dăunător. La începutul pandemiei s-a înțeles că persoanele cu forme foarte grave de Covid-19 erau afectate, pe lângă virus, și de un răspuns imunitar excesiv împotriva SARS-CoV-2. Unele tratamente dovedite acționează prin reducerea acestui răspuns imunitar.

Stația de remodelare

Virusul începe modificările remodelând extensiv interiorul și exteriorul celulei pe care a preluat-o prin translația gazdei, conform nevoilor sale.

Mai întâi, unele proteine spike virale nou formate ajung la suprafața celulei și ies din membrana celulei-gazdă. Acolo activează un canal de ioni de calciu al gazdei, care creează un înveliș lipidic la exteriorul celulei – același înveliș apare și la celulele care fuzionează în mod natural, precum celulele musculare. În acest punct, celula infectată fuzionează cu celule vecine care exprimă ACE2, formând celule respiratorii individuale mari, pline cu până la 20 de nuclei.

Structuri celulare fuzionate (syncytia) observate în celule care exprimă proteina spike SARS-CoV-2 (verde). Nucleii sunt albaștri, iar citoscheletul este roșu. Credit: Mauro Giacca

La 18 aprilie, biologul molecular Mauro Giacca de la King’s College din Londra și echipa sa au publicat o nouă constatare: aceste structuri fuzionate, numite sinciții, sunt induse de infecții virale precum HIV și virusul herpes simplex, dar nu de virusul SARS. Giacca presupune că formarea sincițiilor permite celulelor infectate să se dezvolte mult timp și să răspândească tot mai mulți virioni. „Acesta nu este un virus care lovește și fuge, ci continuă”, spune el. Cercetătorul Qiang Sun de la Academia Chineză de Științe Medicale din Beijing și echipa sa au constatat că unele celule infectate cu Covid-19 formează sinciții cu limfocitele – unul dintre tipurile de celule imunitare proprii ale organismului. Acesta este un mecanism de evitare a imunității cunoscut la celulele tumorale, nu la virusuri. Se sugerează că celulele infectate evită detectarea imună atașându-se de celulele imunitare de supraveghere din apropiere și fuzionând cu ele.

Proteinele implicate în formarea DMV pot fi ținte bune pentru medicamente, deoarece sunt observate în replicarea virală. De exemplu, proteina-gazdă TMEM41B este necesară pentru mobilizarea colesterolului și a altor lipide, astfel încât membranele ER să se extindă și toate componentele virusului să încapă în interior. Vineet Menachery, cercetător în coronavirusuri la Filiala Medicală din Galveston, Texas, participant la cercetare, spune: „Când eliminați TMEM41B, efectul asupra infecției este foarte mare”. Proteina transmembranară a coronavirusului Nsp3 poate fi și ea o țintă: formează un por asemănător unei coroane în pereții DMV pentru a evacua RNA viral nou produs.

Majoritatea virusurilor cu un înveliș extern, numit anvelopă, îl formează asamblându-se chiar la marginea celulei și preluând o parte din propria membrană plasmatică a acesteia în drumul spre ieșire. Însă proteinele nou produse ale coronavirusului urmează o cale diferită.

De ani de zile s-a susținut că coronavirusurile sunt transportate în afara celulei prin complexul Golgi, un organit care funcționează ca un poștaș, împachetând molecule în membrane și trimițându-le în alte părți ale celulei. Acolo, virusul formează o anvelopă lipidică din membrana complexului Golgi; virologa și biologa celulară Carolyn Machamer, care studiază coronavirusurile de 30 de ani la Universitatea Johns Hopkins din Maryland, spune că virionii nou formați sunt apoi transportați în vezicule Golgi la suprafața celulei, unde sunt eliberați.

Totuși, în decembrie, biologa celulară de la Institutul Național pentru Inimă, Plămâni și Sânge din Bethesda, Maryland, SUA, Nihal Altan-Bonnet și colegii săi au raportat că au identificat coronavirusuri care părăsesc celula prin lizozomi – coșuri de gunoi celulare pline cu enzime care descompun părți ale celulei. Altan-Bonnet spune că blocarea căii de secreție bazate pe Golgi nu a influențat cantitatea de virus infecțios eliberată. Dovezile obținute de echipă arată că proteinele virale formează o anvelopă prin înmugurire în ER și apoi preiau lizozomii pentru a ieși din celulă. Cercetătorii testează în prezent inhibitori care blochează procesul ieșirii lizozomale ca potențiali candidați antivirali.

Părăsirea celulei prin Golgi sau lizozomi este lentă și ineficientă comparativ cu înmugurirea prin membrana plasmatică, astfel încât oamenii de știință nu știu de ce SARS-CoV-2 procedează astfel. Machamer bănuiește că alcătuirea lipidică a unei anvelope provenite din Golgi sau lizozomi este cumva mai benefică virusului decât cea din membrana plasmatică. „Dacă am înțelege puțin mai bine această parte, ar exista oportunități mari pentru noi tratamente antivirale”, spune ea.

Finalul

La ieșirea din celulă, încă un eveniment face acest virus contagios: o tăiere rapidă într-o regiune de cinci aminoacizi îl pregătește să își atace următoarea țintă.

În timp ce alte coronavirusuri au un singur aminoacid arginină la joncțiunea subunităților S1 și S2 ale proteinelor spike, SARS-CoV-2 are o secvență de cinci aminoacizi: prolină, arginină, arginină, alanină și arginină. Pöhlmann a spus: „Ne-am concentrat asupra regiunii deoarece este neobișnuită și, da, s-a dovedit necesară pentru invadarea celulelor pulmonare”. În mai 2020, împreună cu colegii săi, a raportat că o proteină a celulei-gazdă numită furină recunoaște și taie această secvență de aminoacizi – și că tăierea este „necesară” pentru intrarea eficientă a virusului în celulele pulmonare umane.

Nu este prima dată când cercetătorii identifică un situs de clivaj al furinei la un virus; Barclay spune că și virusurile gripei aviare înalt patogene îl au. Când un coleg i-a trimis lui Barclay o tulpină SARS-CoV-2 care își pierduse spontan situsul de clivaj al furinei în cultură, echipa sa a constatat că dihorii infectați cu această tulpină eliminau cantități mai mici de particule virale decât cei infectați cu tulpina pandemică și nu transmiteau infecția animalelor din apropiere. Echipa lui Barclay și-a raportat rezultatele într-un preprint din septembrie 2020, iar un studiu efectuat în Țările de Jos a constatat că un coronavirus cu situs de clivaj al furinei intact pătrundea mai rapid în celulele căilor respiratorii umane decât unul fără acest situs.

Se bănuiește că furina taie regiunea în timpul asamblării virionului sau chiar înainte de eliberare. Virologul Tom Gallagher de la Universitatea Loyola din Chicago spune că momentul ar putea explica de ce virusul iese prin Golgi sau lizozomi. „Odată asamblat, virusul intră într-un organit unde poate fi îmbăiat în prezența proteazei furină.”

Gallagher spune că tăierea prin furină rupe legătura dintre subunitățile S1 și S2 și relaxează proteinele spike ale virionului, astfel încât, la intrarea în celulă, acestea răspund unei a doua tăieri efectuate de TMPRSS2, care expune domeniul hidrofob ce se înglobează rapid într-o membrană a celulei-gazdă. Dacă proteinele spike nu au fost tăiate în prealabil de furină – lucru care nu se întâmplă întotdeauna – ele ocolesc TMPRSS2 și intră pe calea endozomală mai lentă, dacă aceasta este disponibilă.

Două variante de coronavirus, Alpha și Delta, și-au modificat situsurile de clivaj ale furinei. În varianta Alfa, primul aminoacid prolină este înlocuit cu histidină (P681H); în varianta Delta, este înlocuit cu arginină (P681R). Barclay spune că ambele modificări fac secvența mai puțin acidă și că, cu cât secvența de aminoacizi este mai bazică, cu atât furina o recunoaște și o taie mai eficient. „Putem presupune că astfel virusul a devenit și mai eficient în transmitere.”

Mai multă tăiere prin furină înseamnă mai multe proteine spike pregătite să intre în celulele umane. Deși Menachery și echipa sa nu au publicat încă studiul în care au numărat proteinele spike pregătite, Menachery spune că, la SARS-CoV, mai puțin de 10% dintre proteinele spike sunt pregătite. La SARS-CoV-2, această proporție ajunge la 50%. La varianta Alfa depășește de asemenea 50%. Echipa a constatat că, la varianta Delta extrem de contagioasă, peste 75% dintre proteinele spike erau pregătite să infecteze o celulă umană.

Necunoscutele cunoscute

Comunitatea științifică abia zgârie suprafața înțelegerii SARS-CoV-2. MacLellan enumeră printre necunoscutele importante numărul receptorilor ACE2 necesari pentru legarea de fiecare proteină spike, momentul exact în care regiunea S2 este tăiată de TMPRSS2 și numărul de proteine spike necesare fuziunii membranelor virală și celulară – iar acestea sunt doar informațiile despre intrarea virusului în celulă. În aprilie 2020, o echipă de la Universitatea California din San Francisco a identificat cel puțin 332 de interacțiuni între SARS-CoV-2 și proteinele umane.

Nu este ușor să ținem pasul cu un virus care suferă rapid mutații. Experții sunt de acord că majoritatea mutațiilor de până acum sunt legate de eficiența răspândirii virusului, nu de cât de mult afectează gazda. Un studiu efectuat luna aceasta a raportat că varianta Delta se multiplică mai rapid și la niveluri mai mari în plămânii și gâtul oamenilor decât versiunile anterioare ale virusului.

Totuși, Stern-Ginossar spune că nu este încă limpede cum întăresc mutațiile Delta varianta în acest mod. „Este ceva ce încearcă să înțeleagă multe laboratoare.”

SUBIECTE CONEXE

• Covid-19: statistici actuale din lume și Turcia
• Ultimele știri și progrese științifice despre coronavirus

Gestionează preferințele pentru a vedea conținutul extern

Gestionează preferințele pentru a vedea conținutul extern