Почему вариант Delta так опасен? Как коронавирус заражает клетки?

Подобно волку в овечьей шкуре, многие вирусы скрываются от иммунной системы человека с помощью гликанов, покрывающих их наружные белки. Специалист по вычислительной биофизической химии Rommie Amaro из Калифорнийского университета в Сан-Диего и её коллеги на основе структурных и генетических данных создали самую подробную на тот момент визуализацию этой оболочки вируса. С помощью суперкомпьютера команда построила изображение атом за атомом.

В течение часа после публикации симуляции в Twitter 22 марта 2020 года один исследователь оставил комментарий: что представляет собой непокрытая петля, выступающая над верхушкой белка?

У Amaro не было ответа на этот вопрос. Но через 10 минут после комментария структурный биолог Jason McLellan из Техасского университета в Остине написал ответ: непокрытая петля — это структура, связывающаяся с рецепторами на клетках человека; это рецептор-связывающий домен (RBD= receptor binding domain), один из трёх участков spike-белка (шипа).

Источник изображения: Structural image from Lorenzo Casalino, Univ. California, San Diego; Graphic: Nik Spencer/Nature

В симуляции Amaro RBD поднимается над облаком гликанов, а два гликана удерживают его на месте, словно подножка велосипеда. Когда Amaro подвергла гликаны в своей компьютерной модели мутациям, RBD опустился. McLellan и его команда разработали способ повторить этот эксперимент в лаборатории и к июню 2020 года сообщили, что мутация двух гликанов снижает способность spike-белка связываться с рецептором клетки человека. По словам McLellan, о такой роли гликанов в коронавирусах прежде никто не знал. Хотя у исследователей пока нет способа уменьшить количество этих двух сахаров, Amaro предполагает, что достижение этой цели могло бы снизить заразность вируса.

С начала пандемии Covid-19 учёные формируют подробное представление о том, как SARS-CoV-2 заражает клетки. Помимо самого процесса заражения, они хотят найти более эффективные способы остановить его с помощью усовершенствованных методов лечения и вакцин и понять, почему новые варианты, такие как Delta, более заразны.

Как коронавирус заражает клетки?

Результатом 19 месяцев работы, опиравшейся на многолетние исследования коронавирусов, стало подробное описание того, как SARS-CoV-2 вторгается в клетки человека. Учёные выявили важные адаптации, помогающие вирусу с удивительной силой прикрепляться к клеткам человека, а затем скрываться внутри них. Выходя из клеток, SARS-CoV-2 выполняет ещё одну чрезвычайно важную операцию, подготавливая свои частицы к заражению новых клеток человека. Это некоторые из механизмов, благодаря которым вирус так быстро распространяется и уносит миллионы жизней. Виролог Wendy Barclay из Имперского колледжа Лондона говорит об этом: «Именно поэтому его так трудно контролировать».

Источник изображения: Hui (Ann) Liu, Univ. Utah; Graphic: Nik Spencer/Nature

С шипами и в готовности заражать

Наружная поверхность каждого вириона SARS-CoV-2 (вирусной частицы) покрыта 24 – 40 случайно расположенными spike-белками, которые играют ключевую роль в слиянии с клетками человека. У других вирусов, например гриппа, белки слияния относительно жёсткие. Однако, согласно опубликованному в августе 2020 года исследованию Martin Beck и коллег из Института биофизики Макса Планка во Франкфурте, Германия, шипы SARS-CoV-2 невероятно гибкие и соединены в трёх точках.

Это позволяет шипам вращаться, качаться и поворачиваться, облегчая исследование поверхности клетки и прикрепление нескольких шипов к одной клетке человека. Beck отметил, что для других коронавирусов нет аналогичных экспериментальных данных, но разумно предположить наличие общего свойства, «поскольку последовательности spike-белков в высокой степени эволюционно консервативны».

Источник изображения: криоэлектронная томография SARS-CoV-2 (Scale bar: 30 nanometres.) Credit: B. Turoňová et al./Science

В начале пандемии исследователи подтвердили, что RBD spike-белков SARS-CoV-2 связываются со знакомым белком, который находится в мембране большинства клеток горла и лёгких человека и называется рецептором ACE2. Этот рецептор также служит точкой прикрепления вируса SARS-CoV, вызывающего тяжёлый острый респираторный синдром (SARS). Однако по сравнению с SARS-CoV новый коронавирус (SARS-CoV-2) связывается с рецептором ACE2 в 2-4 раза прочнее, поскольку ряд изменений в RBD стабилизирует точки связывания вируса.

Проблема вариантов

Вызывающие опасения у SARS-CoV-2 варианты склонны иметь мутации в субъединице S1 spike-белка, которая содержит RBD и отвечает за связывание с рецептором ACE2. (Вторая субъединица шипа, S2, запускает слияние вируса с клеткой-хозяином.)

Например, вариант Alpha содержит 10 изменений в последовательности spike-белка, что повышает вероятность сохранения RBD в «поднятом» положении. Структурный биолог Priyamvada Acharya, изучающая мутации шипа в Институте вакцин человека Дьюка в Северной Каролине, сказала: «Это помогает вирусу продвигаться дальше, облегчая проникновение в клетки».

Распространяющийся сейчас по миру вариант Delta содержит множество мутаций в субъединице S1, три из которых находятся в RBD. Похоже, что эти мутации более прочное связывание RBD с ACE2 и ускользание от иммунной системы у варианта Delta делают более эффективными.

Ограниченный вход

Когда шипы вируса связываются с ACE2, другие белки на поверхности клетки-хозяина запускают процесс, приводящий к слиянию вирусной и клеточной мембран. (Рисунок-4: проникновение вируса)

Источник: Janet Iwasa, Univ. Utah; Graphic: Nik Spencer/Nature

Вызывающий SARS вирус SARS-CoV использует для проникновения в клетку одну из двух протеаз клетки-хозяина: TMPRSS2 (tempress two) или катепсин. TMPRSS2 обеспечивает более быстрый путь проникновения в клетку, но SARS-CoV обычно входит через эндосому — окружённый липидами пузырёк — с помощью катепсина L. Только когда вирионы проникают в клетки этим путём, противовирусные белки могут их перехватить.

SARS-CoV-2 отличается от SARS-CoV тем, что эффективно использует TMPRSS2 — фермент, в большом количестве присутствующий на внешней поверхности клеток дыхательных путей. Сначала TMPRSS2 разрезает участок субъединицы S2 spike-белка. При этом обнажается последовательность гидрофобных аминокислот, которая быстро внедряется в ближайшую мембрану — мембрану клетки-хозяина. Затем вытянувшийся шип складывается сам на себя, словно застёжка-молния, заставляя вирусную и клеточную мембраны сливаться.

Ниже показана анимация слияния SARS-CoV-2 с клетками. Credit: Janet Iwasa, University of Utah

Затем вирус передаёт свой геном непосредственно в клетку. Согласно исследованию, опубликованному в апреле Barclay и её коллегами из Имперского колледжа, проникая таким образом, SARS-CoV-2 заражает быстрее, чем SARS-CoV, и избегает перехвата в эндосомах.

Почему противомалярийный препарат Plaquenil не сработал

Быстрое проникновение вируса с помощью TMPRSS2 объясняет, почему противомалярийный препарат хлорохин, несмотря на первоначально обнадёживающие лабораторные результаты, в клинических испытаниях лечения Covid-19 не оказался эффективным. Выяснилось, что в лаборатории использовались клетки, полагающиеся для эндосомального проникновения только на катепсины. Barclay объясняет: «Когда вирус заражает и размножается в дыхательных путях человека, он не использует эндосомы. Поэтому хлорохин, нарушающий работу эндосом, неэффективен в реальной жизни». Так она объясняет этот результат.

Это наблюдение также указывает на протеазы как на перспективную терапевтическую мишень: можно препятствовать использованию вирусом TMPRSS2, катепсина L или других протеаз для проникновения в клетки-хозяева. Ингибитор TMPRSS2 «камостат мезилат», одобренный в Японии для лечения панкреатита, блокировал проникновение вируса в клетки лёгких, однако в первых клинических испытаниях не улучшал исходы пациентов.

Руководитель отдела инфекционной биологии Немецкого центра приматов в Гёттингене Stefan Pöhlmann, возглавлявший исследования связывания с ACE2 и пути TMPRRS2, говорит: «С моей точки зрения, нам нужны ингибиторы протеаз как противовирусные препараты широкого спектра, чтобы бороться с новыми вспышками заболеваний и предотвращать будущие пандемии с самого начала».

Смертельная конкуренция

Следующие этапы инфекции ещё менее ясны. Химик Janet Iwasa из Университета Юты, создавшая анимацию жизненного цикла вируса с пояснениями, говорит: «После проникновения в клетку остаётся гораздо больше чёрных ящиков. Неопределённости и конкурирующих гипотез становится больше».

Коронавирусы захватывают клеточные механизмы множеством способов. Виролог Noam Stern-Ginossar и её команда сосредоточились на трёх механизмах, с помощью которых SARS-CoV-2 подавляет окружение mRNA хозяина в свою пользу. Stern-Ginossar говорит: «Ни один из них не является специфичным для этого вируса, однако сочетание, скорость и масштаб эффектов делают его уникальным».

• Прежде всего вирус устраняет конкуренцию: когда он стремится проникнуть в клетку человека, первый белок, трансляция которого завершается, — Nsp1 — для систематического разрушения всех клеточных mRNA без вирусной метки захватывает белки хозяина. Однако, когда команда Stern-Ginossar поместила такую же метку на конец mRNA хозяина, оказалось, что эта mRNA не разрушалась.
• Во-вторых, инфекция снижает общую трансляцию белков в клетке на 70%. Согласно работам двух разных исследовательских групп, главным виновником снова является Nsp1. На этот раз он физически перекрывает входной канал рибосом, не позволяя mRNA попасть в рибосому. Stern-Ginossar отмечает, что оставшаяся небольшая трансляционная мощность выделяется вирусным RNA.
• Наконец, вирус отключает систему тревоги клетки. Это происходит разными способами, но команда Stern-Ginossar описала для SARS-CoV-2 конкретный механизм: вирус препятствует выходу из ядра клеточных mRNA, в том числе инструкций для белков, предназначенных для оповещения иммунной системы об инфекции. Другая команда подтвердила это наблюдение и вновь указала на Nsp1: по-видимому, этот белок пережимает выходные каналы ядра, не позволяя ничему выйти. Поскольку генные транскрипты не выходят из ядра, заражённые клетки не выделяют большинство интерферонов — сигнальных белков, предупреждающих иммунную систему о присутствии вируса. SARS-CoV-2 особенно эффективно отключает эту систему тревоги: по сравнению с другими респираторными вирусами, включая SARS-CoV и респираторно-синцитиальный вирус (RSV), инфекция SARS-CoV-2 приводит к значительно более низкому уровню интерферонов. В июне 2021 года исследователи сообщили о мутациях варианта Alpha, которые ещё эффективнее подавляют выработку интерферона.

Stern-Ginossar говорит: «Очевидно, что SARS-CoV-2 — очень быстрый вирус с уникальной способностью мешать нашей иммунной системе распознавать инфекцию и бороться с ней на ранних этапах». Когда иммунная система замечает вирус, его уже настолько много, что белки иммунного ответа иногда поступают в кровоток быстрее обычного, а это может причинять вред. В начале пандемии стало понятно, что люди с очень тяжёлым течением Covid-19 страдают не только от самого вируса, но и от чрезмерно активного иммунного ответа на SARS-CoV-2. Некоторые методы лечения с доказанной эффективностью действуют за счёт ослабления этого иммунного ответа.

Станция переустройства

Взяв под контроль трансляцию клетки-хозяина, вирус приступает к изменениям, существенно перестраивая внутреннюю и внешнюю среду клетки под свои потребности.

Сначала часть вновь образованных spike-белков вируса перемещается на поверхность клетки и выступает из мембраны хозяина. Там они активируют кальциевый ионный канал клетки-хозяина, из-за чего снаружи клетки формируется жировая оболочка; такая же оболочка имеется у естественным образом сливающихся клеток, например мышечных. На этом этапе заражённая клетка сливается с соседними клетками, экспрессирующими ACE2, превращаясь в крупные отдельные клетки дыхательных путей, содержащие до 20 ядер.

Слившиеся клеточные структуры (syncytia), наблюдаемые в клетках, экспрессирующих spike-белок SARS-CoV-2 (зелёный). Ядра синие, а цитоскелет красный. Credit: Mauro Giacca

18 апреля молекулярный биолог Mauro Giacca из Королевского колледжа Лондона и его команда опубликовали новое наблюдение: такие слившиеся структуры, называемые синцитиями, образуются при вирусных инфекциях, например HIV и вирусе простого герпеса, но не при вирусе SARS. Giacca предполагает, что образование синцитиев позволяет заражённым клеткам долго сохраняться и распространять всё больше вирионов. «Это не вирус, который ударяет и уходит; он продолжает действовать», — говорит он. Исследователь Qiang Sun из Китайской академии медицинских наук в Пекине и его команда установили, что некоторые клетки, заражённые Covid-19, образуют синцитии с лимфоцитами — одними из собственных иммунных клеток организма. Такой механизм ускользания от иммунитета известен у опухолевых клеток, но не у вирусов. Предполагается, что заражённые клетки избегают иммунного распознавания, прикрепляясь к находящимся рядом иммунным «разведчикам» и сливаясь с ними.

Белки, участвующие в образовании DMV, могут стать хорошими лекарственными мишенями ввиду их связи с репликацией вируса. Например, для перемещения холестерина и других липидов, расширяющих мембраны ER так, чтобы внутрь помещались все части вируса, необходим белок хозяина TMEM41B. Участвовавший в исследовании специалист по коронавирусам Vineet Menachery из Медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне говорит: «Удаление TMEM41B оказывает сильное влияние на инфекцию». Мишенью также может стать трансмембранный белок коронавируса Nsp3: он формирует в стенках DMV коронообразную пору для выхода вновь образованной вирусной RNA.

Большинство вирусов с наружной оболочкой, называемой конвертом, получают её, собираясь непосредственно у края клетки и захватывая на выходе часть её собственной плазматической мембраны. Но вновь образованные белки коронавируса следуют другим путём.

Многие годы предполагалось, что коронавирусы выводятся из клетки через комплекс Гольджи — органеллу, которая, подобно почте, упаковывает молекулы в мембраны и отправляет их в другие части клетки. Там вирус формирует липидную оболочку из мембраны комплекса Гольджи; затем вновь образованные вирионы в пузырьках Гольджи доставляются к поверхности клетки, где высвобождаются, объясняет Carolyn Machamer — вирусолог и клеточный биолог из Университета Джонса Хопкинса в Мэриленде, изучающая коронавирусы уже 30 лет.

Однако в декабре клеточный биолог из Национального института сердца, лёгких и крови США в Бетесде, Мэриленд, Nihal Altan-Bonnet и её коллеги сообщили, что обнаружили коронавирусы, покидающие клетку через лизосомы — клеточные мусорные баки, заполненные ферментами, расщепляющими части клетки. По словам Altan-Bonnet, блокирование секреторного пути через комплекс Гольджи не влияло на количество высвобождаемого заразного вируса. Полученные командой данные показывают, что вирусные белки формируют оболочку, отпочковываясь в ER, а затем захватывают лизосомы для выхода из клетки. Сейчас исследователи испытывают ингибиторы лизосомального выхода как потенциальные противовирусные кандидаты.

Покидать клетку через комплекс Гольджи или лизосомы медленнее и менее эффективно, чем отпочковываться от плазматической мембраны, поэтому учёные не знают, почему SARS-CoV-2 действует именно так. Machamer предполагает, что липидный состав оболочки, полученной из комплекса Гольджи или лизосомы, чем-то выгоднее для вируса, чем оболочка из плазматической мембраны. «Если бы мы немного лучше понимали этот этап, открылись бы большие возможности для новых противовирусных средств», — говорит она.

Финал

При выходе из клетки ещё одно событие делает этот вирус заразным: быстрое расщепление в участке из пяти аминокислот подготавливает его к атаке следующей мишени.

Там, где другие коронавирусы имеют одну аминокислоту аргинин в месте соединения субъединиц S1 и S2 своих шипов, у SARS-CoV-2 находится последовательность из пяти аминокислот: пролин, аргинин, аргинин, аланин и аргинин. «Мы сосредоточились на этом участке, потому что он необычен, и оказалось, что он действительно необходим для вторжения в клетки лёгких», — сказал Pöhlmann. В мае 2020 года он и его коллеги сообщили, что белок клетки-хозяина под названием фурин распознаёт и расщепляет эту аминокислотную последовательность и что такое расщепление «необходимо» для эффективного проникновения вируса в клетки лёгких человека.

Это не первый случай обнаружения исследователями участка расщепления фурином у вируса; по словам Barclay, он есть и у высокопатогенных вирусов птичьего гриппа. Когда коллега прислал ей штамм SARS-CoV-2, который самопроизвольно потерял участок расщепления фурином в культуре, её команда установила, что заражённые этим штаммом хорьки выделяли меньше вирусных частиц, чем заражённые пандемическим штаммом, и не передавали инфекцию находившимся рядом животным. Команда Barclay сообщила о результатах в препринте в сентябре 2020 года, а исследование в Нидерландах также показало, что коронавирус с сохранным участком расщепления фурином проникал в клетки дыхательных путей человека быстрее, чем вирус без него.

Предполагается, что фурин расщепляет этот участок во время сборки вириона или непосредственно перед его высвобождением. Виролог Tom Gallagher из Университета Лойолы в Чикаго говорит, что время этого события может объяснять, почему вирус выходит через комплекс Гольджи или лизосомы. «После сборки вирус попадает в органеллу, где может омываться протеазой фурином».

По словам Gallagher, расщепление фурином разрывает связь между субъединицами S1 и S2 и ослабляет spike-белки вириона, чтобы они могли отреагировать на второе расщепление TMPRSS2 при проникновении в клетку: оно обнажает гидрофобный участок, быстро внедряющийся в мембрану клетки-хозяина. Если шипы заранее не расщеплены фурином, что бывает не всегда, они обходят TMPRSS2 и входят более медленным эндосомальным путём, если он доступен.

Два варианта коронавируса, Alpha и Delta, изменили свои участки расщепления фурином. У варианта Alpha первая аминокислота пролин заменяется гистидином (P681H), а у варианта Delta — аргинином (P681R). По словам Barclay, обе замены делают последовательность менее кислой, а чем она более основная, тем эффективнее фурин распознаёт и расщепляет её. «Можно предположить, что в результате вирус стал ещё эффективнее передаваться».

Большее число расщеплений фурином означает больше spike-белков, готовых к проникновению в клетки человека. Хотя Menachery и его команда ещё не опубликовали исследование, в котором подсчитывали готовые spike-белки, Menachery говорит, что у SARS-CoV были готовы менее 10% шипов. У SARS-CoV-2 эта доля возрастает до 50%. У варианта Alpha она также превышает 50%. Команда установила, что у чрезвычайно заразного варианта Delta более 75% шипов были готовы заразить клетку человека.

Известные неизвестные

Научное сообщество всё ещё лишь касается поверхности понимания SARS-CoV-2. MacLellan перечисляет важные неизвестные: сколько рецепторов ACE2 необходимо для связывания с каждым spike-белком, в какой именно момент участок S2 расщепляется TMPRSS2 и сколько шипов необходимо для слияния вирусной и клеточной мембран; и всё это касается только проникновения вируса в клетку. В апреле 2020 года команда Калифорнийского университета в Сан-Франциско выявила по меньшей мере 332 взаимодействия между белками SARS-CoV-2 и человека.

Успевать за быстро мутирующим вирусом непросто. Эксперты согласны, что большинство выявленных до сих пор мутаций связано с эффективностью распространения вируса, а не с тем, насколько сильно он вредит хозяину. В исследовании, проведённом в этом месяце, сообщалось, что вариант Delta размножается быстрее и достигает более высоких уровней в лёгких и горле людей, чем предыдущие версии вируса.

Однако Stern-Ginossar говорит, что пока неясно, каким образом мутации Delta усиливают вариант именно так. «Это то, что пытаются понять многие лаборатории».

ПО ТЕМЕ

• Covid-19: актуальная статистика в мире и Турции
• Последние новости и научные открытия о коронавирусе

Измените настройки для просмотра внешнего контента

Измените настройки для просмотра внешнего контента