CAR NK: новая эра лечения рака естественными клетками-киллерами иммунной системы

Получаемая модификацией T-клеток CAR T терапия впервые в 2017 году при лейкозе и лимфоме Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) одобрение получила и начала новую эру клеточной иммунотерапии в лечении рака. Теперь перед нами новое живое противоопухолевое лекарство, более эффективное и с меньшими побочными эффектами: CAR NK-клеточная терапия.

«Естественные киллеры» иммунной системы (natural killer = NK) — группа клеток врождённого иммунитета, впервые обнаруженная у мышей в 1975 году. Различными поверхностными клеточными рецепторами обладающие NK-клетки по-разному распределены в здоровых тканях, но большинство находится в крови, печени, селезёнке и костном мозге. Небольшая часть присутствует в лимфатических узлах. NK-клетки стоят в первом ряду защиты организма от патогенов. При заражении нормальных клеток вирусом они быстро активируются без необходимости предшествующей встречи и формируют защитные ответы.

Развитие технологий и исследования последних лет помогают лучше понимать иммунологию опухоли / её связь с иммунной системой. Работы с NK-клетками чрезвычайно интересны исследователям. Обнаружено, что NK-клетки, полученные из разных источников — костного мозга донора, эмбриональных стволовых клеток человека, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, периферической крови, пуповинной крови — и перенесённые пациенту, формируют более сильные противоопухолевые ответы. Однако выделение этих NK-клеток и размножение в лаборатории — крайне сложный процесс. Благодаря технологии клонирования клеток созданы однородные высокочистые линии NK-клеток с устойчивыми функциональными свойствами: KHYG-1, NK-92, NKL, NKG и YT. Они облегчили проведение масштабных экспериментов. Модификация линии NK-92 посредством CAR (chimeric antigen receptor — химерного антигенного рецептора), обеспечивающая сильные противоопухолевые свойства, открыла путь клиническому применению.

Хотя NK-клетки экспрессируют разные поверхностные биомаркеры, наиболее примечательны CD56 и CD16. По интенсивности экспрессии CD56 и CD16 NK-клетки разделяют на две группы: CD56bright и CD56dim.

CD56dim NK-клетки полностью зрелые и составляют около %90 NK-клеток крови. Эта группа отвечает за цитотоксический / убивающий клетки ответ и участвует в антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности. Напротив, CD56bright NK-клетки незрелые и находятся преимущественно в тканях и вторичных лимфоидных органах. Клетки CD56bright экспрессируют очень мало CD16 на поверхности. Поэтому их основная роль в иммунном ответе — секреция цитокинов, таких как интерферон (IFN)-гамма, фактор некроза опухоли (TNF)-альфа, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий (GMCS) фактор, IL-10 и IL-13.

NK-клетки распознают «чужих» с помощью поверхностных «активирующих NK-рецепторов» и «ингибирующих NK-рецепторов». Эти рецепторы распознают молекулу главного комплекса гистосовместимости I (MHC-I), присутствующую на поверхности всех ядросодержащих клеток организма. Это указывает на здоровье встреченной клетки, активирует ингибирующий NK-рецептор, и NK-клетка не уничтожает мишень.

Описание рисунка выше: a) Своя / дружественная клетка: NK-клетка распознаёт молекулу MHC-I на поверхности клетки и отказывается уничтожать мишень. b) Клетка с отсутствующим «своим»: Клетка-мишень не экспрессирует на поверхности молекулу MHC-I. Тогда NK-клетка получает стимулирующие сигналы от активирующих рецепторов и начинает уничтожать клетку. c) Клетка в состоянии стресса: Если клетка-мишень экспрессирует изменённый MHC-I или стрессовые молекулы, NK-клетки распознают и уничтожают её. d) Чужая клетка: Клетка-мишень экспрессирует чужеродный MHC-I и стимулирует цитотоксические механизмы NK-клеток. Так мишень уничтожается.

При заражении здоровой клетки вирусом или образовании опухоли поверхностная молекула MHC-I исчезает. Тогда активирующий рецептор NK-клетки приходит в действие и уничтожает мишень тремя различными путями:

1. Перфориновый/гранзимный путь: Перфорин, хранящийся в пузырьках внутри NK-клеток, выделяется наружу и повышает проницаемость поверхности клетки-мишени. Затем поступающий гранзим вызывает апоптоз, приводя клетку к гибели.
2. Путь Fas/FasL: Соединение двух молекул Fas и FasL передаёт мишени сигнал смерти, и в течение нескольких часов она уничтожается апоптозом.
3. Цитокиновый путь: NK-клетки выделяемыми цитокинами, например TNF-альфа, нарушают стабильность лизосом клетки-мишени. Так высвобождаются гидролитические ферменты, разрушающие её ДНК, и клетка уничтожается.

Клетки NK-92

Линия NK-92 — единственная линия NK-клеток, одобренная Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) для клинических исследований фазы 1 и фазы 2. NK-92 почти не имеют «ингибирующих рецепторов», но обильно экспрессируют «активирующие». Высокое содержание перфорина и гранзима также указывает на широкую цитотоксическую активность.

Для оценки эффективности в лечении рака проведено много исследований линии NK-92. Например, в работах с клетками лейкоза и миеломы обнаружено, что клетки NK-92 обладают сильным цитотоксическим действием и эффективно их уничтожают.

Химерные антигенные рецепторы (CAR) и линия NK-92

Хотя CAR T-терапия с мишенью CD19 одобрена FDA, у неё много ограничений, прежде всего нежелательные побочные эффекты и цитокиновый шторм. CAR T-терапия не даёт успешных результатов при солидных / твёрдых опухолях; возникают и такие трудности, как долгое производство из собственных T-клеток пациента и сложность сбора достаточного их количества. Получение T-клеток от донора может преодолеть эти трудности, но несёт риск реакции «трансплантат против хозяина», вызывающей нарушение функций органов.

Основные преимущества CAR NK-92 — высокая цитотоксичность и возможность быстро производить большое количество однородных клеток.

Также более короткая, чем у CAR-T, жизнь в организме уменьшает возможные побочные эффекты.

Ниже упрощённо изложен механизм действия терапии anti-CD19 CAR-NK.

Каковы преимущества терапии CAR NK-92?

CAR NK-92-клеточная терапия благодаря множеству преимуществ конкурирует с CAR T. Среди этих преимуществ;

1. CAR NK-92 не вызывает реакцию «трансплантат против хозяина» и обладает более эффективным цитотоксическим действием.
2. CAR NK-92 может непосредственно нацеливаться на опухоль и уничтожать мишень посредством активации NK-92.
3. Даже при исчезновении целевого антигена с поверхности опухоли CAR NK-92 продолжает действовать благодаря «активирующим рецепторам».
4. «Ингибирующие рецепторы» слабо представлены на поверхности NK-92; удаление и имеющихся рецепторов делает NK-92 более устойчивыми для солидных опухолей по сравнению с другими иммунными клетками.
5. Бессмертные клетки NK-92 имеют стабильный фенотип / внешний вид и могут долго размножаться в лаборатории.
6. T-клетки для CAR T-терапии необходимо собирать из собственной крови пациента. Но среди возникающих проблем — недостаточное количество T-клеток или нарушения в них, из-за которых они недостаточно распознают опухолевые клетки. Кроме того, сам человек за один раз может произвести лишь 1 дозу CAR-T, что увеличивает стоимость. Для NK-клеток такого ограничения нет. Собранные у донора NK-клетки также можно использовать для CAR-NK-терапии.

Ниже представлены клинические исследования рака, в которых испытывалась CAR NK-терапия:

Каковы трудности терапии CAR NK-92?

Несмотря на эффективные противоопухолевые свойства, остаются проблемы, которые ещё нужно решить:

• Линия NK-92 получена от пациентов со злокачественной неходжкинской лимфомой. Это может привести к образованию вторичной опухоли. Также после переноса NK-92 может возникнуть восприимчивость к вирусу Эпштейна—Барр. Поэтому для повышения безопасности перед клиническим применением следует облучать клетки, предотвращая возможные побочные эффекты. Исследования показывают, что даже после облучения NK-92 сохраняют способность к размножению и уничтожению клеток.
• При облучении высокой дозой период полужизни NK-92 сокращается. Это приводит к ослаблению противоопухолевых свойств. Для предотвращения этого могут понадобиться многократные инъекции CAR NK-92.
• Наиболее распространённый способ запустить экспрессию CAR в NK-клетках — генетическая модификация с вирусными векторами. Для этого возможны разные векторы. Цель — поместить генетическую информацию для экспрессии CAR в NK-клетку. Однако метод может иметь отрицательные стороны: высокую стоимость векторов, длительный и сложный производственный цикл. Также нет гарантии, что нужная генетическая информация с помощью вектора встроится в нужную область. Это может повредить нормальные гены и запустить аномальные клеточные циклы. Для устранения этих проблем в последние годы начали применять систему CRISPR-Cas9.
• CAR NK-92 атакуют конкретный антиген на опухоли. Но если эти антигены также выделяются здоровыми клетками организма, могут возникнуть нежелательные токсические эффекты. Поэтому для сохранения безопасных границ лечения следует внимательно относиться к вводимой дозе.
• Короткая жизнь CAR NK-клеток в организме ограничивает терапию ими. Последние результаты позволяют предположить, что NK-клетки памяти могут быть более подходящими для адоптивной CAR NK-терапии благодаря длительной жизни и продолжительной активности.