Что такое Crispr-cas9? Механизм, технология, расшифровка
В этой статье
CRISPR-Cas9 — инструмент, созданный на основе защитной системы бактерий против вирусов и позволяющий разрезать ДНК в нужном месте. Вопреки распространённому утверждению, его открыли не в 2013 году — это год первого применения системы в человеческих клетках. Сегодня это уже не только лабораторная технология: с 16 ноября 2023 года существует одобренный препарат.
В этой статье решаются три задачи. Во-первых, с указанием источников исправляются семь заблуждений, распространённых в турецкоязычных материалах: от даты открытия и функций отдельных ферментов до перевода сокращения. Во-вторых, объясняется работа системы с деталями, которые часто упускают: направляющая РНК, последовательность PAM и восстановление после разреза — именно здесь фактически происходит «редактирование». В-третьих, ставится главный для онкологии вопрос: Каково место CRISPR в лечении рака?
Ответим на последний вопрос сразу, поскольку именно здесь возникает больше всего недоразумений: На сегодняшний день ни одного метода лечения рака с помощью CRISPR не одобрено. Единственный одобренный препарат CRISPR, Casgevy, предназначен для серповидноклеточной анемии и бета-талассемии — обе болезни не относятся к раку. Все онкологические программы CRISPR пока находятся на фазе 1 или 1-2. Это не означает неудачу направления; ожидания пациентов необходимо согласовывать с сегодняшней реальностью — вот что это означает.
Сначала семь исправлений
| Распространённое утверждение | Как обстоит дело в действительности |
|---|---|
| "«Открытая в 2013 году CRISPR-Cas9» | Неверно. Повторяющиеся последовательности в 1987 году случайно обнаружили Yoshizumi Ishino и его коллеги у E. coli. Сокращение в 2001–2002 годах получило своё название. Иммунная функция в 2005 году была предложена, в марте 2007 года экспериментально доказана. 2013 — год первого применения системы для редактирования генома в человеческих клетках — а не год открытия. |
| "Фермент Cas9 сканирует и разрезает фрагменты вирусной ДНК. Бактерия встраивает эти фрагменты в свой геном и формирует память». | Механизмы перепутаны. Формирование памяти выполняют не Cas9, а Cas1 и Cas2 (в системах типа II также участвует Csn2). Функция Cas9 ограничена этапом вмешательства (interference). Кроме того, порядок обратный: сначала записывается память (при первой встрече), разрезание происходит позже (при повторном заражении). |
| «С помощью CRISPR ДНК ВИЧ из человеческих клеток успешно удалили" | Слишком категоричное утверждение. В лаборатории встроенную ДНК ВИЧ удаётся разрезать. Однако EBT-101 в исследовании фазы 1/2 (представленном в мае 2024 года) из пяти участников лечение прекратили трое; у всех троих вирус вернулся и антиретровирусную терапию возобновили. Лечение признали безопасным, однако оно никого не излечило. |
| «В опытах на мышах при мышечной дистрофии исправили мутацию, родилось здоровое потомство" | Это утверждение для данной статьи подтвердить не удалось; оно вводит в заблуждение, поскольку создаёт представление о наследуемом редактировании зародышевой линии (germline). Его исключили из текста. |
| «CRISPR = кластеры палиндромных повторов, разделённых через регулярные промежутки» | Перевод содержит две ошибки. «Interspaced» означает не «разделённые» , а расположенные через регулярные промежутки, заполненные другими последовательностями ; кроме того, слово «Short» («Короткие») пропущено. Более точный перевод: «Кластеризованные короткие палиндромные повторы, расположенные через регулярные промежутки». |
| «Cas = CRISPR-associated system" | Когда речь идёт о ферменте, правильная расшифровка: «CRISPR-associated protein»— Cas9 = CRISPR-ассоциированный белок 9. Выражение «CRISPR-associated system» описывает семейство генов/локусов. |
| В статье направляющая РНК, последовательность PAM и пути репарации вообще не упоминаются | Именно они составляют принцип работы системы. Направляющая РНК определяет мишень, PAM разрешает разрез, а само «редактирование» при восстановлении после разреза происходит. Без этих трёх компонентов объяснить CRISPR невозможно; ниже им посвящены отдельные разделы. |
Правильная хронология
Механизм: что на самом деле происходит в бактерии?
CRISPR — иммунная система, и, как любая иммунная система, в три этапа работает: запоминание, подготовка, атака. В турецкоязычных материалах эти этапы часто сжимают в одно предложение и приписывают ферментам чужие функции.
| Этап | Что происходит? | Какие белки? |
|---|---|---|
| 1. Приобретение (адаптация) Запись памяти |
При первом заражении из ДНК вторгшегося агента берётся короткий фрагмент и в последовательность CRISPR между двумя повторами как новый спейсер встраивается. | Cas1 и Cas2 (в типе II также участвует Csn2). Cas1 является интегразой. Единственная роль Cas9 здесь — помогать фрагментам, соседствующим с PAM, отбираться для этого процесса. |
| 2. Экспрессия (образование crRNA) Подготовка |
Последовательность CRISPR копируется в длинную pre-crRNA и перерабатывается в короткие, содержащие по одному спейсеру crRNAмолекулы. | В типе II отдельная малая РНК — tracrRNA — спаривается с областью повтора; RNase III разрезает её, высвобождая зрелую crRNA. |
| 3. Вмешательство (interference) Атака |
При повторном заражении комплекс с загруженной crRNA перемещается по клетке, ищет PAM, раскрывает ДНК и спаривает спейсер с расположенным напротив протоспейсером; при соответствии разрезает обе цепи. | Cas9 — и только на этом этапе. |
Рисунок 1 · Три этапа иммунитета CRISPR
Сначала бактерия записывает память, затем производит направляющую РНК и лишь в конце разрезает ДНК. Cas9, выполняющий разрезание, не записывает память.
Различие спейсера и протоспейсера: Спейсер— заимствованная у чужеродного агента последовательность, хранящаяся между повторами в собственной последовательности CRISPR бактерии, то есть запись памяти. Протоспейсер— исходная соответствующая последовательность в геноме фага или плазмиды, то есть мишень. Последовательность одна и та же, но одна копия находится в памяти, другая — у врага.
Три компонента инструмента: направляющая РНК, PAM и разрез
Направляющая РНК
| crRNA | Зрелая направляющая, происходящая из спейсера, длиной около 20 нуклеотидов . Спаривается основаниями с целевым протоспейсером. |
|---|---|
| tracrRNA | Отдельная малая РНК, комплементарная области повтора. В системах типа II необходима и для созревания crRNA, и для её загрузки в Cas9. Группа Charpentier, март 2011. |
| sgRNA (единая направляющая РНК) |
Инженерная форма crRNA и tracrRNA, объединённых в одну молекулу при конструировании. Именно этот шаг превратил бактериальную иммунную систему в программируемый инструмент — Jinek, Chylinski, Charpentier и Doudna, 2012. |
PAM: предохранительный замок системы
PAM (protospacer adjacent motif)— короткий мотив ДНК, который должен находиться непосредственно рядом с целевой последовательностью. Streptococcus pyogenes для его Cas9 стандартный PAM — 5'-NGG-3'(N = любое основание). В геноме человека NGG встречается примерно через каждые 8–12 оснований— поэтому большинство генов доступны для нацеливания.
Без PAM Cas9 не разрезает ДНК. Распознавание PAM — первый шаг, позволяющий раскрыть ДНК и начать спаривание оснований.
Самая изящная функция PAM — предотвращать разрезание бактерией самой себя. Рядом со спейсерами в последовательности CRISPR бактерии PAM отсутствует; рядом с протоспейсерами в геноме фага он присутствует. Поэтому та же crRNA, которая уничтожает фаг, не может нацелиться на собственную запись памяти бактерии. Проблема различения «своего» и «чужого» в иммунной системе решена мотивом длиной всего два-три основания. Природа предотвратила аутоиммунитет с помощью знака препинания.
Где и как происходит разрез?
Cas9 создаёт двухцепочечный разрыв на 3 пары оснований выше PAM . Работают два отдельных нуклеазных домена: HNH разрезает цепь, комплементарную crRNA, RuvC — противоположную цепь. Среди образующихся разрывов примерно %85 имеют тупые концы (blunt), остальные — слегка ступенчатые.
Само «редактирование» происходит после разреза
Здесь часто допускают концептуальную ошибку: CRISPR не выполняет «вырезать и вставить». CRISPR только разрезает. Результат — выключение или исправление гена — определяет собственный механизм репарации клетки. Существуют два пути, и выбор во многом зависит от состояния клетки, которое нам неподконтрольно.
| NHEJ (негомологичное соединение концов) | HDR (репарация на основе гомологии) | |
|---|---|---|
| Нужна ли матрица? | Нет | Да — сестринская хроматида или донорская ДНК, введённая извне |
| Точность | Подвержен ошибкам; часто оставляет небольшие вставки/делеции (инделы) после восстановления | Благодаря использованию матрицы безошибочный |
| Результат | Индел, не кратный трём → сдвиг рамки считывания → преждевременный стоп-кодон → выключение гена (knockout) | Исправление точечной мутации или вставка новой последовательности |
| Когда работает? | На протяжении клеточного цикла на любом этапе, в том числе в неделящихся клетках | Преимущественно в фазах S и G2 — то есть только в активно делящихся клетках |
| В неделящейся клетке (нейрон, мышца) | Работает | Практически неприменим |
Рисунок 2 · Два пути репарации после разреза
CRISPR только разрезает. Будет ли результатом выключение гена или его исправление, зависит от того, какой путь репарации использует клетка.
Эта таблица объясняет главное техническое ограничение направления. Ген нарушить легко: NHEJ работает повсюду. Ген исправить гораздо труднее: HDR включается лишь в делящихся клетках и только в определённом временном окне клеточного цикла; к тому же конкурирует с NHEJ за один разрыв. Поэтому большинство методов CRISPR, дошедших до клиники, основаны на «выключении чего-либо», а не на «исправлении чего-либо» — включая Casgevy. О значении расположения мутации внутри гена мы говорили в другой статье; здесь эта логика действует в обратную сторону: исправить мутацию намного сложнее, чем распознать её.
Cas9 — не единственный вариант
| Фермент | Мишень | PAM | Разрез | Особенность |
|---|---|---|---|---|
| Cas9 (S. pyogenes) | ДНК | 5'-NGG-3', со стороны 3' | Двухцепочечный разрыв с тупыми концами | Стандартный вариант; необходимы crRNA + tracrRNA (или sgRNA) |
| Cas12a (Cpf1) | ДНК | 5'-TTTV-3', со стороны 5' | Ступенчатый, с липкими концами | Открывает доступ к AT-богатым мишеням; не требует tracrRNA, перерабатывает собственную pre-crRNA |
| Cas13 | РНК | PAM для ДНК отсутствует | Разрезание РНК | Подавление РНК, редактирование РНК и диагностические тесты |
| SaCas9 (S. aureus) | ДНК | — | Двухцепочечный разрыв | Благодаря малому размеру помещается в вирусный вектор; используется там, где SpCas9 не помещается |
Как доставить в клетку? Ex vivo и in vivo
Разделение ex vivo / in vivo в исходной статье верно, но неполно: решающее значение имеет выбор используемого переносчика.
| Переносчик | Куда | Применение | Примечание |
|---|---|---|---|
| Электропорация RNP (предварительно собранный белок Cas9 + направляющая РНК) |
В клеточную культуру | Золотой стандарт ex vivo — кроветворные стволовые клетки и Т-клетки | Самое быстрое действие, самая короткая продолжительность, наименьший риск внецелевого воздействия |
| Липидная наночастица (LNP) | При внутривенном введении преимущественно в печень | Основной in vivo невирусный путь | Переносит мРНК или RNP; временная экспрессия |
| AAV | Направленно в ткань (глаз, нервная система, мышцы) | In vivo | Предел упаковки ~4,7 kb — поэтому нужны малые Cas9 либо приёмы с двойным вектором |
| Лентивирус | Встраивается в геном хозяина | Преимущественно ex vivo — производство стволовых клеток и CAR-T | Обеспечивает постоянную экспрессию |
Casgevy: первый в мире одобренный препарат CRISPR
В этом разделе рассматривается важнейшее достижение направления, совсем не упоминавшееся в исходной статье. Casgevy (действующее вещество exagamglogene autotemcel, сокращённо exa-cel) разработан Vertex Pharmaceuticals и CRISPR Therapeutics.
| Дата | Регулятор | Решение |
|---|---|---|
| 16 ноября 2023 | Британское агентство MHRA | Первая в мире зарегистрированная терапия CRISPR/Cas9. Серповидноклеточная анемия и трансфузионно-зависимая бета-талассемия, возраст 12 лет и старше |
| 8 декабря 2023 | FDA США | При повторяющихся вазоокклюзионных кризах: серповидноклеточная анемия, возраст 12 лет и старше |
| 16 января 2024 | FDA США | Трансфузионно-зависимая бета-талассемия, возраст 12 лет и старше |
| 13 февраля 2024 | Европейская комиссия | Условная регистрация, оба показания, возраст 12 лет и старше |
| 1 июля 2026 | FDA США | Возрастной порог снижен до 2 лет — для обоих показаний |
Одобрения MHRA и ЕС ограничены пациентами, которым подходит трансплантация стволовых клеток и для которых нет HLA-совместимого родственного донора среди доступных вариантов.
Как это работает? У пациента забирают собственные CD34+ кроветворные стволовые клетки, затем в лаборатории с CRISPR/Cas9 эритроид-специфическую энхансерную область гена BCL11A редактируют. В норме BCL11A подавляет фетальный гемоглобин (HbF) ; снятие этого подавления вновь запускает образование HbF. Фетальный гемоглобин не образует серповидных форм и заменяет дефектный взрослый бета-глобин — поэтому одно редактирование помогает и при серповидноклеточной анемии, и при бета-талассемии.
Обратите внимание: дефектный ген не исправляют. Вместо этого вновь включают выключенный после рождения другой ген. Это прямое следствие описанного выше ограничения NHEJ–HDR: выключить легче, чем исправить.
Рисунок 3 · Casgevy не исправляет дефектный ген — он вновь включает другой
Дефектный при серповидноклеточной анемии ген бета-глобина вообще не затрагивают. Вместо этого вновь задействуют фетальный гемоглобин, выключенный после рождения.
| Исследование | Пациенты | Результат |
|---|---|---|
| CLIMB-121 тяжёлая серповидноклеточная анемия |
Пролечены 35 пациентов, 17 доступны для оценки | 16/17 (%94,1) не менее 12 последовательных месяцев без вазоокклюзионных кризов; 17/17 (%100) не менее 12 месяцев без госпитализаций по поводу кризов. Средняя продолжительность без кризов — 18,7 месяца (максимум 36,5). HbF на 3-м месяце превысил %30 общего гемоглобина, затем ~%40. |
| CLIMB-111 трансфузионно-зависимая бета-талассемия |
Пролечены 48 пациентов, 27 доступны для оценки | 24/27 (%88,9) не менее 12 последовательных месяцев без трансфузий, средневзвешенный Hb ≥9 g/dL. Средняя продолжительность — 20,5 месяца (максимум 40,7). Общий Hb на 3-м месяце ≥11, с 6-го месяца ≥12 g/dL. |
Продолжительность наблюдения в обоих исследованиях до 43,7 месяца достигала. У всех пациентов клетки прижились, случаев злокачественных новообразований не сообщалось. Профиль безопасности описан как «соответствующий миелоаблативному кондиционированию бусульфаном и аутологичной трансплантации стволовых клеток».
Однако без объяснения того, через что проходит пациент, эти цифры вводят в заблуждение. Casgevy — это не таблетка и не просто инфузия; это процесс трансплантации стволовых клеток:
(1) Сбор стволовых клеток после мобилизующего препарата методом афереза — до недели, при необходимости повторяется. (2) Производство клеток вне центра и испытания для выпуска препарата — до шести месяцев. (3) В стационаре в течение нескольких дней проводится подготовительная химиотерапия бусульфаном. (4) Однократная внутривенная инфузия. (5) После инфузии — 4–6 недель в стационаре. Ранние риски — кровотечение и инфекция из-за снижения тромбоцитов и лейкоцитов. В собственной памятке производителя для пациента сказано: «После получения подготовительного препарата вы можете утратить возможность забеременеть или стать отцом».
Прейскурантная цена в США составляет 2,2 миллиона долларов. Общие рамки обсуждения доступности и ценообразования представлены в наших статьях о ценах на онкологические препараты и карте доступа к новым лекарствам , к которым можно обратиться. Статус регистрации и возмещения стоимости Casgevy в Турции для этой статьи подтвердить не удалось; никаких утверждений по этому вопросу не делается.
Следующее поколение: редактирование оснований и прайм-редактирование
Главная проблема Cas9 — образование двухцепочечного разрыва; как показано ниже в разделе безопасности, именно разрыв порождает основную часть риска. Для обхода этой проблемы лаборатория David Liu разработала два метода.
| CRISPR-Cas9 | Редактирование оснований | Прайм-редактирование | |
|---|---|---|---|
| Тип разрыва | Двухцепочечный разрыв | Одноцепочечный надрез | Двухцепочечного разрыва нет |
| Что позволяет сделать | Разрезает и оставляет восстановление клетке | C→T и A→G переходы (трансверсии невозможны) | Все 12 замен оснований, а также небольшие вставки и удаления |
| Нужна ли матричная ДНК | Для HDR — да | Нет | Нет |
| Публикация | 2012–2013 | Лаборатория Liu (точные годы подтвердить не удалось) | Anzalone и соавторы, Nature, 2019 |
И самый впечатляющий случай в этой области: KJ Muldoon. Младенцу с тяжёлой недостаточностью карбамоилфосфатсинтетазы 1 (CPS1) — нарушением цикла мочевины с накоплением токсичного аммиака в крови — в Детской больнице Филадельфии и Penn Medicine специально для его варианта разработанную терапию редактирования оснований доставили в печень с помощью липидных наночастиц.
Первую дозу в феврале 2025 годаввели примерно в возрасте 6–7 месяцев; в марте и апреле 2025 года ввели ещё две дозы. От определения варианта до производства прошло менее шести месяцев. По состоянию на апрель 2025 года серьёзных побочных эффектов не наблюдали: ребёнок переносил больше белка, нуждался в меньшем количестве лекарств и перенёс вирусную инфекцию без повышения аммиака. New England Journal of Medicine, 15 мая 2025.
Значение этого случая намного шире улучшения состояния одного пациента: он показал, что терапию можно для одного-единственного человека разработать и произвести за несколько месяцев. Современная модель разработки лекарств для редких мутаций экономически невозможна; этот подход способен её изменить. Однако это экспериментальное применение, а не одобренный препарат.
CRISPR и рак: где мы находимся на самом деле?
В исходной статье рак назван одним из направлений, где «CRISPR рассматривается как революционный подход». Это верно, но неполно. Конкретная ситуация такова:
Первое американское исследование CRISPR при раке (Пенсильвания, 2020)
| Количество пациентов | 3 (распространённый рак) |
|---|---|
| Что сделали | В Т-клетках выключили три гена — TRAC и TRBC (цепи собственного Т-клеточного рецептора) и PDCD1 (PD-1); затем с помощью лентивирусного вектора синтетический TCR, специфичный к NY-ESO-1, добавили |
| Безопасность | Серьёзных нежелательных явлений, связанных с лечением, не было |
| Сохранение клеток | Отредактированные клетки сохранялись месяцами — дольше, чем было документировано ранее; у одного пациента на 4-м месяце ~%20 циркулирующих Т-клеток всё ещё несли несколько изменений |
| Эффективность | Объективного ответа не было. У двух пациентов — стабилизация, у одного — смешанный ответ (уменьшение некоторых очагов на ~%50 сохранялось ~4 месяца, другие прогрессировали). К завершению исследования прогрессирование было у всех, один пациент умер. |
Ценность этого исследования — в информации о безопасности, а не в лечебном эффекте. Показано, что Т-клетки с одновременным редактированием трёх генов могут месяцами сохраняться у человека без серьёзной токсичности. Но они не уменьшили опухоль. Важно сохранять это различие: «CRISPR испытали при раке и признали безопасным» — верно; «CRISPR вылечил рак» — неверно.
Аллогенные CAR-T: наиболее реалистичное применение CRISPR в онкологии
Современная CAR-T-терапия является аутологичной: у пациента берут собственные Т-клетки, инженерно модифицируют и возвращают. Процесс занимает недели и дорого стоит. Аллогенные CAR-T производят из клеток здорового донора и могут применять в готовом виде — но донорские Т-клетки атакуют ткани пациента. Для решения этой проблемы используют CRISPR: выключают Т-клеточный рецептор и гены тканевой совместимости.
| Количество пациентов | 12, четыре уровня дозы (30, 100, 300, 600 ×10⁶ CAR+ Т-клеток) |
|---|---|
| Заболевания | Рецидивирующие/рефрактерные В-клеточные злокачественные новообразования: фолликулярная лимфома, лимфома маргинальной зоны, мантийноклеточная лимфома, крупноклеточная В-клеточная лимфома |
| Общая частота ответа | 8/12 (%67) |
| Полный ответ | 6/12 (%50) |
| Продолжительность ответа | Один полный ответ сохранялся более 12 месяцев; пять ответов — дольше 6 месяцев |
| Токсичность | Дозолимитирующей токсичности нет; инфекций степени 3 и выше нет. Синдром высвобождения цитокинов — у 7/12, только степени 1–2; ICANS — у 4/12, только степени 1–2; GvHD не наблюдалась |
| Регуляторное решение | FDA 9 декабря 2024 года для фолликулярной лимфомы и лимфомы маргинальной зоны RMAT присвоило этот статус |
Данные обнадёживают, но это исследование с 12 пациентами, фаза 1. Ответы при разных уровнях дозы и отсутствие GvHD значимы; однако нет данных о стойкости эффекта, долгосрочной безопасности и сравнении с аутологичными CAR-T. Попытки применения CAR-T при солидных опухолях мы обсуждали в статьях о B7-H3 CAR-T при глиобластоме и терапии, нацеленной на B7-H3 , опубликованных ранее.
В лаборатории: CRISPR-скрининг и новые мишени
Возможно, крупнейший вклад CRISPR в онкологию пока состоит не в лечении, а в поиске мишеней . При полногеномном CRISPR-нокаутном скрининге тысячи генов поочерёдно выключают и определяют, без какого гена конкретная раковая клетка не выживает.
Классический пример такого подхода — хеликаза WRN. Natureв 2019 году опубликовал исследование, показавшее, что опухоли с микросателлитной нестабильностью (MSI) зависят от хеликазы WRN, а клетки без MSI — нет. Таким образом, WRN для молекулярно определённой группы пациентов является селективно летальной мишенью — при MSI-положительном колоректальном раке, раке эндометрия и желудка. Эта мишень появилась не при наблюдении пациентов, а на экране скрининга. Обсуждение поиска лекарств с помощью искусственного интеллекта Virtual Biotech мы уже рассматривали; CRISPR-скрининг — экспериментальный аналог этого направления.
Безопасность: честный раздел
Риски CRISPR в популярных описаниях обычно сводят к «внецелевым разрезам». Однако часть документированных проблем возникает точно в мишени — то есть риск создаёт само разрезание правильного участка.
| Проблема | Источник | Что обнаружено? |
|---|---|---|
| Проблема p53 | Haapaniemi и соавторы, Nature Medicine, 11 июня 2018 | Разрез Cas9 запускает p53-опосредованный ответ на повреждение ДНК и остановку клеточного цикла. Следствие вызывает тревогу: легче всего редактируются клетки с нарушенным путём p53. Поскольку p53 — ключевой опухолевый супрессор, авторы при разработке клеточной терапии на основе CRISPR наблюдать за функцией p53 прямо рекомендовали. |
| Крупные делеции и сложные перестройки | Kosicki, Tomberg, Bradley, Nature Biotechnology 2018;36:765–771 | Двухцепочечные разрывы Cas9 могут вызывать удаления длиной в килобазы и сложные перестройки — причём при генотипировании стандартной короткоампликонной ПЦР они остаются незамеченными. |
| Хромотрипсис | Nature Genetics 2021 | Раздробление хромосомы с неправильным соединением фрагментов — явление, связанное с раковыми геномами, — описано как результат разреза Cas9, целевой, а не внецелевой по своему происхождению. |
Это не означает, что CRISPR нельзя использовать, но требует понимания трёх обстоятельств.
Во-первых: Большая часть риска из двухцепочечного разрыва происходит. Отсутствие такого разрыва при редактировании оснований и прайм-редактировании — теоретическое преимущество безопасности; поэтому направление движется к этим методам.
Во-вторых: Клинические данные пока обнадёживают. В исследованиях Casgevy при наблюдении до 43,7 месяца злокачественных новообразований не сообщалось; в онкологическом исследовании Penn серьёзных связанных с терапией нежелательных явлений не было. Но для вопроса о риске рака это короткий срок наблюдения — а бусульфан в подготовительном режиме сам по себе несёт известный риск вторичных злокачественных новообразований.
В-третьих: Документированные клинические последствия внецелевого разрезания и официальную позицию регуляторов о долгосрочном онкологическом риске терапии отредактированными клетками для этой статьи подтвердить не удалось. Это не утверждение «риска нет», а «на этот вопрос пока не ответили» — именно такой смысл.
He Jiankui и запрет наследуемого редактирования
| 26 ноября 2018 | He Jiankui объявляет, что с геномами, отредактированными CRISPR, родились девочки-близнецы . Целевой ген — CCR5; цель — обеспечить устойчивость к ВИЧ. |
|---|---|
| Реакция | 122 китайских учёных публикуют заявление, называющее работу «неэтичной» и «безумной». Председатель гонконгского саммита, нобелевский лауреат David Baltimore выражает «ужас и печаль»; оргкомитет саммита 28 ноября называет вмешательство «безответственным» и нарушающим международные нормы. Критика касается недостаточного информированного согласия, нераскрытых рисков и отсутствия экспертного рецензирования. |
| 30 декабря 2019 | Народный суд района Наньшань в Шэньчжэне признаёт его виновным в незаконной медицинской практике: три года заключения и штраф 3 миллиона юаней. Двое коллег получают два года и 18 месяцев заключения. |
| Апрель 2022 | После отбытия наказания выходит на свободу. |
| Сегодня | Всемирная организация здравоохранениячерез экспертный комитет, созданный в 2018 году, пришла к выводу, что наследуемое редактирование человеческого генома по-прежнему слишком рискованно и не должно применяться на практике. Китайв 2020 году изменил Гражданский и Уголовный кодексы, запретив редактирование человеческих генов в репродуктивных целях и установив наказание до семи лет. |
Этот случай преподносит урок и для онкологии. Технически действия He Jiankui не были сложными — дешевизна и простота CRISPR как раз считались его главными достоинствами. Барьер заключался в институтах, а не в технике; один человек смог их обойти. Все методы терапии отредактированными клетками, предлагаемые сегодня онкологическим пациентам, соматические— они затрагивают только самого пациента и не передаются следующим поколениям. При разговоре с пациентом это различие необходимо чётко объяснить: CAR-T и подобные методы лечения не меняют геном ваших детей.
Нобелевская премия и патент: чьё это открытие?
Нобелевская премия по химии 2020 годаприсуждена Emmanuelle Charpentier и Jennifer A. Doudna поровну «за разработку метода редактирования генома» . Поскольку премию могут разделить только три человека, многие участники остались без награды, что вызвало споры.
| Кто | Вклад |
|---|---|
| Feng Zhang | Обеспечил работу CRISPR-Cas9 в человеческих клетках (3 января 2013). Предпочтение Академией фундаментальной науки прикладной истолковали как «важный сигнал» на фоне патентного спора США–ЕС. |
| Virginijus Šikšnys | Получил тот же биохимический результат; его статья по сравнению со статьёй Jinek и коллег была отправлена раньше , но опубликована позже из-за отклонения без рецензирования. В 2018 году разделил премию Кавли по нанонауке с Doudna и Charpentier. |
| Francisco Mojica | Дал название CRISPR и предложил иммунную функцию (2005) |
| Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath | Экспериментально доказали функцию (2007) |
Подтвердить для этой статьи критические публикации с источниками об отсутствии Mojica, Barrangou и Horvath среди лауреатов не удалось; даты их вклада подтверждены. Подробнее о Нобелевском процессе можно прочитать в нашей статье о Нобелевской премии по химии 2020 года по этой теме.
Патентный спор ещё не завершён. Сторона Berkeley (CVC) 25 мая 2012 года, а Broad Institute 12 декабря 2012 года подали заявки; Broad после ускоренного рассмотрения в апреле 2014 года получил первый патент. Апелляционный патентный совет США 15 февраля 2017 года и 28 февраля 2022 года вынес решения в пользу Broad. Однако 12 мая 2025 года Федеральный апелляционный судоценку Советом «формирования замысла изобретения» отменил и вернул дело на пересмотр: использовался неверный правовой критерий. Правильный критерий — было ли изобретение «достаточно завершённым, чтобы специалисты могли осуществить его без дополнительного изобретательства». Вопрос приоритета до сих пор не решён.
Комментарий Академии DROZDOGAN
При обновлении статьи больше всего привлекло внимание, что сведения, требующие исправления, не столько ошибочны, сколько устарели и чрезмерно оптимистичны . Текст о CRISPR, написанный в 2018–2020 годах, не мог включать главное достижение — существование одобренного препарата. Но он также не отражает главного ограничения: для лечения рака одобренной терапии CRISPR всё ещё нет.
⚡ Почему это важно
Пациенты с раком и их близкие слышат о CRISPR и справедливо спрашивают: «Подходит ли это мне?» Честный сегодняшний ответ — нет, но пока нет. Наиболее реалистичное применение в онкологии — редактирование не опухоли, а иммунной клетки редактирует: аллогенные CAR-T. В исследовании CTX112 с 12 пациентами, фаза 1, ответ %67 и отсутствие GvHD — значимый сигнал; однако 12 пациентов — это всего 12 пациентов.
✅ Сильная сторона
Casgevy доказал, что редактирование генов — уже зарегистрированный препарат, а не обещание . Результаты хорошие: при серповидноклеточной анемии 16/17 пациентов более года без кризов, при талассемии 24/27 пациентов не зависят от трансфузий. При наблюдении до 43,7 месяца злокачественных новообразований не сообщалось. Ещё впечатляющее выглядит случай KJ Muldoon: терапия для одного младенца, разработанная менее чем за шесть месяцев. Это доказательство, способное перестроить экономику разработки лекарств для редких заболеваний.
⚠️ Слабая сторона
Три направления. Биология: CRISPR упростил разрезание, но не исправление: HDR работает лишь в делящихся клетках, поэтому большинство клинических методов — «выключение», а не «исправление»; даже Casgevy не ремонтирует дефектный ген, а выключает другой. Безопасность: Отбор по p53, делеции длиной в килобазы и хромотрипсис — целевые проблемы, и вопрос долгосрочного риска рака пока не получил ответа. Доступность: Прейскурантная цена 2,2 миллиона долларов, производство до шести месяцев, подготовка бусульфаном, 4–6 недель в больнице и риск постоянного бесплодия — это процесс трансплантации, а не таблетка.
🩺 Что сказать пациенту
(1) Сегодня одобренной терапии CRISPR для рака нет; все онкологические программы находятся на исследовательском этапе. (2) Участие в клиническом исследовании не равнозначно получению одобренного лечения; основная цель фазы 1 — безопасность, а не уменьшение опухоли. (3) Соматическое редактирование не передаётся следующим поколениям: CAR-T-подобное лечение не меняет геном ваших детей. (4) Будьте крайне осторожны с нелицензированными платными центрами, обещающими «лечение рака с CRISPR»: сегодня такой одобренной услуги нет. (5) Реальный прогресс достигнут в гематологии и редких заболеваниях; это может предвещать успех в онкологии, но не гарантирует его.
❓ Открытые вопросы
Терапия отредактированными клетками через десять лет несёт ли риск вторичных злокачественных новообразований? Максимальное доступное наблюдение для ответа — 43,7 месяца, а собственный риск подготовительного режима мешает оценке. Второй вопрос: действительно ли редактирование оснований и прайм-редактирование уменьшают риск, устраняя двухцепочечный разрыв, или лишь создают иной профиль риска? Третий, важнейший для онкологии: могут ли аллогенные CAR-T по сравнению с аутологичными CAR-T быть столь же эффективными ? Преимущества готового продукта в цене и доступности могут быть ценными даже при небольшом снижении эффективности, но этот компромисс ещё не измерен.
Вывод: История CRISPR началась в 1987 году с нескольких непонятных повторов и в 2023 году привела к зарегистрированному препарату — тридцать шесть лет. Это показывает, насколько медленно действует слово «революция». Сегодня есть действительно работающая терапия двух наследственных болезней крови, экспериментальная терапия для младенца, разработанная за месяцы, и обнадёживающие, но очень ранние данные фазы 1 в онкологии. Верная формулировка — не «CRISPR победит рак», а «CRISPR может помочь, редактируя не раковую клетку, а атакующую её клетку»; доказательства этого пока получены лишь у 12 пациентов. Из памяти, которую бактерии записывали против вирусов, появился препарат; для рака он тоже может появиться, но пока не появился.
Часто задаваемые вопросы
- Когда открыли CRISPR?
- Повторяющиеся последовательности в 1987 году случайно обнаружили, сокращение в 2001–2002 годах ввели, иммунную функцию в 2005 году предложили и в 2007 году доказали, программируемые ножницы в 2012 году продемонстрировали, в человеческих клетках 3 января 2013 года применили. Частое утверждение «открыли в 2013 году» ошибочно.
- Как расшифровывается CRISPR?
- Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — «Кластеризованные короткие палиндромные повторы, расположенные через регулярные промежутки». Частый перевод «разделённые» неверен: «interspaced» означает, что повторы разделены промежутками с другими последовательностями между ними. Cas применительно к ферменту означает «CRISPR-associated protein» (CRISPR-ассоциированный белок).
- Что такое PAM и почему он важен?
- Это короткий мотив ДНК, который должен находиться непосредственно рядом с мишенью; S. pyogenes для его Cas9 — 5'-NGG-3'. Без PAM Cas9 не разрезает ДНК. Самая изящная функция — благодаря отсутствию PAM рядом с записями в собственной последовательности CRISPR бактерии предотвращать разрезание самой себя.
- Действительно ли CRISPR работает как «вырезать и вставить»?
- Нет — CRISPR только разрезает. Результат определяет собственный механизм репарации клетки. NHEJ не требует матрицы, подвержен ошибкам и обычно выключает ген; HDR использует матрицу и способен исправлять, но работает только в делящихся клетках и в определённом окне клеточного цикла. Поэтому «нарушить ген» легко, а «исправить ген» трудно.
- Есть ли одобренный препарат CRISPR?
- Да, один: Casgevy (exagamglogene autotemcel). Великобритания — 16 ноября 2023, США — 8 декабря 2023 (серповидноклеточная анемия) и 16 января 2024 (бета-талассемия), Европа — 13 февраля 2024. В США 1 июля 2026 года возрастной порог снижен до 2 лет.
- Есть ли одобренная терапия CRISPR для рака?
- Нет. Все онкологические программы CRISPR находятся в фазе 1 или 1-2. Самое перспективное направление — получаемые с CRISPR аллогенные CAR-T клетки; в исследовании CTX112 с 12 пациентами, фаза 1, сообщалось о %67 общего ответа и %50 полного ответа; FDA 9 декабря 2024 года присвоило статус RMAT. Это ускорение разработки, а не одобрение.
- Вылечили ли ВИЧ с помощью CRISPR?
- Нет. В лаборатории встроенную ДНК ВИЧ удаётся разрезать. Однако EBT-101 в исследовании фазы 1/2 из трёх участников, прекративших антиретровирусную терапию, у всех троих вирус вернулся и терапию возобновили; у одного подавление сохранялось 16 недель. Лечение признали безопасным, но никого не излечили: добраться до всех клеток со скрытым ВИЧ не удалось.
- Передастся ли лечение CRISPR моим детям?
- Нет. Все применяемые сегодня у пациентов методы редактирования генов соматические — они затрагивают только клетки тела получающего лечение человека и не передаются следующим поколениям. Редактирование половых клеток (наследуемое редактирование) ВОЗ считает слишком рискованным; во многих странах, включая Китай, оно запрещено.
- Вызывает ли CRISPR рак?
- Сегодня вопрос открыт, и честный ответ — «пока неизвестно». Есть три документированные причины опасений: разрез Cas9 отбирает клетки с нарушенным путём p53 (2018), делеции длиной в килобазы может создавать (2018), а хромотрипсис описан как целевое последствие (2021). При этом клинические данные пока обнадёживают: в исследованиях Casgevy при наблюдении до 43,7 месяца злокачественных новообразований не сообщалось. Однако для вопроса о риске рака это короткий срок.
- Отличается ли редактирование оснований от CRISPR?
- Оно использует ту же систему наведения, но не создаёт двухцепочечного разрыва: надрезает одну цепь и осуществляет замену C→T или A→G. Прайм-редактирование без разрывов позволяет выполнить все 12 замен оснований и небольшие вставки/удаления. Поскольку основной риск связан с двухцепочечным разрывом, теоретически эти методы безопаснее.
Словарь
- CRISPR
- Короткие палиндромные повторяющиеся последовательности в геномах бактерий и архей, разделённые фрагментами чужеродной ДНК. Запись памяти адаптивной иммунной системы.
- Cas9
- CRISPR-ассоциированный белок 9. ДНК-эндонуклеаза с РНК-наведением; действует только на этапе вмешательства.
- Cas1 / Cas2
- Белки, отвечающие за встраивание новых спейсеров в последовательность CRISPR, то есть за запись памяти. Cas1 — интеграза.
- Спейсер
- Заимствованная у чужеродного агента последовательность, хранящаяся между повторами в CRISPR бактерии. Запись памяти.
- Протоспейсер
- Исходная последовательность генома фага или плазмиды, совпадающая со спейсером. Мишень.
- PAM
- Protospacer adjacent motif. Короткий мотив, необходимый непосредственно рядом с мишенью; S. pyogenes для его Cas9 — 5'-NGG-3'. Необходимое условие разрезания.
- crRNA
- Направляющая РНК длиной около 20 нуклеотидов, происходящая из спейсера.
- tracrRNA
- Отдельная малая РНК, необходимая в системах типа II для созревания crRNA и загрузки в Cas9.
- sgRNA
- Объединённые в одну молекулу crRNA и tracrRNA. Инженерный шаг, превращающий CRISPR в программируемый инструмент.
- NHEJ
- Негомологичное соединение концов. Репарация без матрицы, подверженная ошибкам; оставляет малые инделы и обычно выключает ген.
- HDR
- Репарация на основе гомологии. Использует матрицу, безошибочна, но работает преимущественно в делящихся клетках.
- Индел
- Небольшая вставка или делеция. Если не кратна трём, вызывает сдвиг рамки считывания.
- Ex vivo
- Извлечение клеток из организма, их редактирование и возвращение обратно.
- In vivo
- Введение компонентов редактирования непосредственно в организм пациента.
- Редактирование оснований
- Метод превращения одного основания в другое без двухцепочечного разрыва (C→T, A→G).
- Прайм-редактирование
- Система «найти и заменить», напрямую записывающая новую генетическую информацию без разрыва и донорской ДНК.
- Аллогенные CAR-T
- CAR-T, полученные от здорового донора, а не из собственных клеток пациента. CRISPR используют для выключения генов, предотвращая атаку донорских клеток на пациента.
- RMAT
- Regenerative Medicine Advanced Therapy. Статус FDA, ускоряющий разработку продуктов регенеративной медицины; не является одобрением.
- Хромотрипсис
- Раздробление хромосомы с последующим соединением в неправильном порядке. Явление, встречающееся в раковых геномах.
Примечание о прозрачности.
Что подтверждено: Наблюдение Ishino в 1987 году и организм; работы Mojica 1993–2000; введение сокращения в 2001–2002 и описание cas1–cas4; демонстрация совпадения спейсеров с фагами тремя группами в 2005 году и иммунная гипотеза Mojica; экспериментальное доказательство Barrangou–Horvath в марте 2007; Marraffini–Sontheimer 2008; определение Moineau места разреза в декабре 2010; открытие tracrRNA группой Charpentier в марте 2011; Jinek и соавторы, Science 337:816–821 и объединение sgRNA; Gasiunas–Šikšnys, PNAS 4 сентября 2012 и история отказа 18 апреля 2012; одновременные публикации Zhang и Church от 3 января 2013 и доля %2–38 в статье Church; Scienceвыбор от 18 декабря 2015 и два попадания на второе место; трёхэтапный механизм, распределение функций Cas1/Cas2/Csn2 и Cas9, определения спейсера и протоспейсера; определения crRNA/tracrRNA/sgRNA; последовательность PAM, частота в геноме и предотвращение самоповреждения; разрез за 3 основания до PAM, разделение функций HNH/RuvC и %85 разрывов с тупыми концами; свойства NHEJ и HDR, ограничение HDR фазами S/G2; свойства Cas12a, Cas13 и SaCas9; пути доставки и ограничение AAV ~4,7 kb; пять регуляторных решений Casgevy с датами, механизм эритроидного энхансера BCL11A, результаты CLIMB-121 и CLIMB-111, наблюдение 43,7 месяца без сообщений о злокачественных новообразованиях, этапы лечения, предупреждение о бесплодии и прейскурантная цена в США 2,2 миллиона долларов; ссылка Anzalone 2019 о прайм-редактировании и происхождение редактирования оснований из лаборатории Liu; диагноз KJ Muldoon, учреждения, даты доз, производство менее чем за шесть месяцев и публикация 15 мая 2025 в NEJM ; дизайн исследования Penn фазы 1, три гена, три пациента и отсутствие объективного ответа; данные CTX112 фазы 1 и дата RMAT 9 декабря 2024; Haapaniemi 2018 о p53, Kosicki 2018 о крупных делециях и данные 2021 о хромотрипсисе; результаты EBT-101 фазы 1/2; WRN/MSI, Nature данные 2019; даты случая He Jiankui, наказание и освобождение, заявление 122 учёных и реакция Baltimore; сведения о Нобелевской премии 2020 и официальное обоснование; премия Кавли Šikšnys в 2018 году; даты патентного дела и решение Федерального апелляционного суда от 12 мая 2025.
Что не удалось подтвердить: Даты отправки и онлайн-публикации статьи Jinek и соавторов; Scienceдва года, когда CRISPR занимал второе место; полная ссылка на статью Barrangou–Horvath 2007; согласовали ли сокращение в 2001 или 2002 году (приведены оба); критические публикации с источниками об отсутствии Mojica, Barrangou и Horvath среди нобелевских лауреатов; отношение эффективности NHEJ–HDR; годы первых публикаций о редактировании оснований; ссылка на статью Ihry и соавторов 2018 о p53; документированные клинические последствия внецелевых разрезов; официальная позиция регуляторов о долгосрочном онкологическом риске терапии отредактированными клетками; данные CTX110 и CTX130; онкологические программы Caribou, Intellia и Beam (включая BEAM-201); детали проекта DepMap; цена Casgevy вне США и число уже пролеченных пациентов; ген-мишень NTLA-2001; точные ссылки на документы ВОЗ по управлению 2021 года; регистрация и возмещение стоимости Casgevy в Турции, а также наличие в Турции клинических исследований CRISPR — по этим вопросам никаких утверждений не сделано. Фраза исходного текста «в опытах на мышах исправили мышечную дистрофию, родилось здоровое потомство» не включена: подтвердить её не удалось, и она создаёт представление о наследуемом редактировании.
Источник критических оценок: Оценки «2013 — год применения, а не открытия», «CRISPR не вырезает и вставляет, а только разрезает», «большинство клинических методов выключают, поскольку это проще исправления», «Casgevy — процесс трансплантации, а не таблетка» и «в онкологии вернее говорить о редактировании клетки, атакующей опухоль, а не самой опухоли» принадлежат этой статье. Напротив, предупреждение об отборе по p53, собственные формулировки EMA и FDA, отсутствие ответа в исследовании Penn и данные о хромотрипсисе принадлежат самим источникам.
Декларация интересов: Мы не связаны ни с одним из упомянутых в статье лекарств, продуктов или предприятий.
Источники
- Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Journal of Bacteriology 1987;169(12):5429–5433.
- Broad Institute. «Хронология CRISPR». broadinstitute.org
- Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. «Программируемая ДНК-эндонуклеаза с двойным РНК-наведением в адаптивном иммунитете бактерий». Science 2012;337(6096):816–821.
- Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Šikšnys V. PNAS 2012;109:E2579–E2586.
- Cong L, и соавторы. Science 2013;339(6121):819–823; Mali P, и соавторы. Science 2013;339(6121):823–826. Обе — 3 января 2013.
- AAAS. «Science выбирает инструмент редактирования генома CRISPR прорывом 2015 года». 18 декабря 2015. aaas.org
- The Nobel Prize in Chemistry 2020. nobelprize.org
- Vertex Pharmaceuticals / CRISPR Therapeutics. Объявления MHRA (16 ноября 2023), FDA (8 декабря 2023 и 16 января 2024), Европейской комиссии (13 февраля 2024) и о расширении возраста FDA (1 июля 2026).
- Vertex Pharmaceuticals. Результаты ключевых исследований CLIMB-121 и CLIMB-111, срез данных EHA 2023.
- European Medicines Agency. Casgevy EPAR. ema.europa.eu
- Stadtmauer EA, June CH, и соавторы. «Т-клетки, инженерно модифицированные CRISPR, у пациентов с рефрактерным раком». Science 2020. doi:10.1126/science.aba7365
- CRISPR Therapeutics. Данные CTX112 фазы 1, ASH 2024; объявление RMAT 9 декабря 2024.
- Anzalone AV, и соавторы. Прайм-редактирование. Nature 2019.
- Penn Medicine и Children's Hospital of Philadelphia. Сообщения о случае KJ Muldoon; New England Journal of Medicine, 15 мая 2025.
- Haapaniemi E, Botla S, Persson J, Schmierer B, Taipale J. «Редактирование генома CRISPR–Cas9 вызывает p53-опосредованный ответ на повреждение ДНК». Nature Medicine 2018;24(7).
- Kosicki M, Tomberg K, Bradley A. «Репарация двухцепочечных разрывов, вызванных CRISPR–Cas9, приводит к крупным делециям и сложным перестройкам». Nature Biotechnology 2018;36:765–771.
- «Хромотрипсис как целевое последствие редактирования генома CRISPR–Cas9». Nature Genetics 2021.
- Excision BioTherapeutics. Промежуточные результаты EBT-101 фазы 1/2, ASGCT, май 2024.
- «Хеликаза WRN — синтетически летальная мишень в опухолях с микросателлитной нестабильностью». Nature 2019.
- United States Court of Appeals for the Federal Circuit, решение 22-1653, 12 мая 2025.
Источники
CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.
Nature Biotechnology 32, 347–355 (2014)
2. Chen Liang, Mark A. Wainberg, Atze T. Das and Ben Berkhout.
CRISPR/Cas9: a double-edged sword when used to combat HIV infection.
Retrovirology 2016.
3. Rafal Kaminski, Yilan Chen, Tracy Fischer, Ellen Tedaldi, Alessandro Napoli, Yonggang Zhang, Jonathan Karn, Wenhui Hu & Kamel Khalili.
Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing.
Scientific Reports 6, Article number: 22555 (2016)
Эта статья была полезна?
Ваш отзыв помогает нам улучшать материалы.
Комментарии читателей
Оставьте комментарий
Ваше имя и комментарий публикуются только после одобрения администратором. Ваш адрес электронной почты никогда не показывается посетителям.
Будьте первым, кто оставит комментарий.